대사유체

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1. 개요

대사유체(Flux Balance Analysis, FBA)는 대사 네트워크를 선형 방정식 시스템으로 표현하여 세포의 대사 상태를 예측하는 수학적 모델링 기법이다. 1980년대 초에 연구가 시작되었으며, 화학량론적 행렬과 플럭스 벡터를 사용하여 대사 반응의 속도를 계산한다. FBA는 정상 상태와 최적화를 가정하며, 선형 계획법을 통해 주어진 제약 조건 하에서 최적의 플럭스 분포를 찾아 세포의 성장이나 특정 대사 산물 생산 등을 예측한다. 유전자/반응 삭제 및 억제, 배지 최적화 등의 시뮬레이션에 활용되며, 플럭스 변동성 분석(FVA), 대사 조정 최소화(MOMA), 조절 On-Off 최소화(ROOM), 동적 FBA 등으로 확장되었다. 다른 기술과의 비교를 통해 FBA의 장단점을 파악할 수 있으며, 미생물 균주 개발, 질병 메커니즘 연구, 신약 개발, 맞춤 의학 등 다양한 분야에 응용될 수 있다.

대사유체

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2. 역사

대사 유체 균형 분석(FBA)에 대한 초기 연구는 1980년대 초로 거슬러 올라간다. 파푸차키스는 대사 맵을 사용하여 유속 균형 방정식을 구성하는 것이 가능함을 증명했다. 그러나, 선형 계획법과 목표 함수를 사용하여 대사 경로의 유속을 계산하는 아이디어를 처음으로 제시한 사람은 왓슨이었다. 첫 번째 중요한 연구는 펠과 스몰에 의해 발표되었는데, 이들은 유속 균형 분석과 더 정교한 목표 함수를 함께 사용하여 지방 합성에 대한 제약 조건을 연구했다.

3. 원리

플럭스 균형 분석(FBA)은 대사 네트워크를 분석하는 접근 방식으로, 전통적인 상미분 방정식 기반 모델링과 달리 효소의 동역학적 정보나 대사 물질의 농도에 대한 상세한 정보 없이도 시스템을 분석할 수 있다. 이는 크게 두 가지 핵심 가정에 기반한다: [[정상 상태]] 가정과 최적화 가정이다.

정상 상태 가정은 분석 대상 시스템이 안정적인 상태에 도달하여 시스템 내 대사 물질들의 농도가 시간에 따라 변하지 않는다고 가정한다. 즉, 각 대사 물질이 생성되는 속도와 소비되는 속도가 같다고 본다. 최적화 가정은 생물체가 진화 과정에서 성장이나 자원 활용 등 특정 생물학적 목표를 가장 효율적으로 달성하도록 대사 흐름을 최적화했다고 가정한다.

이 두 가정을 바탕으로, FBA는 대사 네트워크를 일련의 선형 방정식으로 표현한다. 일반적으로 대사 반응의 수가 대사 물질의 수보다 많기 때문에, 이 시스템은 해가 여러 개 존재할 수 있는 언더-디터민드(under-determined) 시스템이 된다. FBA는 여기에 선형 계획법이라는 수학적 최적화 기법을 적용하여, 주어진 제약 조건(화학량론적 균형, 반응 속도 상하한 등) 하에서 특정 [[목적 함수]](objective function)의 값을 최대화하거나 최소화하는 대사 경로의 속도(플럭스) 분포를 찾는다. 가장 흔하게 사용되는 목적 함수는 세포의 성장 속도를 나타내는 생물량(biomass) 생산 속도이다.

이러한 접근 방식 덕분에 FBA는 복잡한 생화학적 정보 없이도 대사 네트워크의 전반적인 작동 원리와 잠재적 능력을 예측하는 데 유용하게 활용된다.

3.1. 정상 상태 가정

플럭스 균형 분석(FBA)은 전통적인 상미분 방정식 기반 모델링과 달리, 시스템 내 효소의 동역학적 매개변수나 대사 물질의 농도에 대한 정보가 거의 필요하지 않다. 이는 [[정상 상태]](steady state)와 최적화라는 두 가지 핵심 가정을 통해 가능하다.

정상 상태 가정은 모델링 대상 시스템이 정상 상태에 도달했다는 것을 전제로 한다. 이는 시스템 내 대사 물질들의 농도가 더 이상 시간에 따라 변하지 않으며, 각 대사 물질에 대해 생성되는 속도(플럭스)와 소비되는 속도(플럭스)가 정확히 같아 서로 상쇄되는 상태를 의미한다. 즉, 특정 대사 물질 노드(node)에서 들어오는 플럭스의 합과 나가는 플럭스의 합이 동일하다.

이 가정은 생물 공정 공학에서 발효기 내 미생물 세포의 성장을 모델링하기 위해 사용된 [[물질 수지]](material balance) 개념에서 유래했다. 미생물이 성장하는 과정에서 영양분(기질)을 소비하여 세포 자체(생물량)를 생성하는데, 이 과정을 물질 수지로 표현하면 다음과 같다.

: $\mathrm{입력} = \mathrm{출력} + \mathrm{축적}$

여기서 '입력'은 시스템으로 들어오는 물질(예: 기질), '출력'은 시스템에서 나가는 물질(예: 생성된 생물량), '축적'은 시스템 내부에 쌓이는 물질의 양 변화를 의미한다. 미생물 세포 시스템이 정상 상태에 있다고 가정하면, 시스템 내 물질의 양이 시간에 따라 변하지 않으므로 '축적' 항은 0이 된다. 따라서 물질 수지 방정식은 다음과 같이 단순화된다.

: $\mathrm{입력} = \mathrm{출력}$
: 또는, $\mathrm{입력} - \mathrm{출력} = \mathrm{0}$

이 개념을 대사 네트워크 전체로 확장하면, 네트워크 내 모든 대사 반응을 화학량론적으로 균형 잡힌 방정식들의 집합으로 나타낼 수 있다. 이를 행렬 형식으로 표현하면, 각 반응의 화학량론적 계수를 모아놓은 행렬 $S$ (화학량론적 행렬)와 각 반응의 속도(플럭스)를 나타내는 벡터 $\mathbf{v}$ 의 곱으로 나타낼 수 있다. 정상 상태 가정 하에서는 시스템 내 모든 대사 물질의 농도 변화가 없으므로, 이 곱은 0이 된다.

: $\qquad S \cdot\mathbf{v} = \mathbf{0}$

대사 네트워크는 일반적으로 분석 대상인 대사 물질의 수보다 관련된 반응의 수가 더 많다. 이는 위 방정식이 미지수(플럭스 벡터 $\mathbf{v}$ 의 각 성분)의 개수가 방정식의 개수보다 많은 선형 연립방정식 시스템(under-determined system)임을 의미한다. 이러한 시스템의 해, 즉 가능한 플럭스 분포는 무수히 많을 수 있으며, 특정 조건을 만족하는 해를 찾기 위해 선형 계획법과 같은 최적화 기법이 사용된다.

정상 상태 가정의 주요 장점은 대사 물질의 구체적인 농도나 시스템의 복잡한 효소 동역학에 대한 상세한 지식 없이도 대사 흐름을 분석할 수 있다는 점이다. 시스템이 항상성을 유지하며 정상 상태에 있다고 가정하면, 대사 물질 농도가 일정하게 유지되므로 각 반응의 구체적인 반응 속도식을 고려할 필요가 없어진다. 오직 반응들의 화학량론적 관계(행렬 $S$ )만으로도 특정 목적 함수(예: 생물량 생산 최대화)를 만족하는 최적의 플럭스 분포를 수학적으로 계산할 수 있다. 예를 들어, 다양한 배양 조건에서 원핵생물인 대장균(E. coli)의 성장 속도를 예측하는 데 성공적으로 사용되었으며, 생명 공학 분야에서 특정 유용 물질의 생산량을 예측하고 최적화하는 데에도 활용된다.

3.2. 최적화 가정

플럭스 균형 분석(FBA)은 상미분 방정식을 이용한 전통적인 모델링 방식과 달리, 효소의 동역학적 정보나 대사 물질의 정확한 농도 없이도 대사 네트워크를 분석할 수 있다. 이는 크게 두 가지 핵심 가정을 바탕으로 하는데, 그중 하나가 최적화 가정(optimality assumption)이다. 다른 하나는 정상 상태 가정이다.

최적화 가정이란 생물체가 진화의 과정을 거치면서 특정 생물학적 목표를 가장 효율적으로 달성하도록 자신의 대사 흐름을 최적화했다는 생각에 기반한다. 여기서 생물학적 목표는 빠른 성장(생물량 생산 극대화), ATP 생산 효율 증대, 혹은 제한된 자원을 최대한 아껴 쓰는 것 등이 될 수 있다.

이 가정은 플럭스 균형 분석에서 선형 계획법(Linear Programming, LP)이라는 수학적 기법을 적용하는 근거가 된다. 선형 계획법은 여러 제약 조건 하에서 특정 목적 함수(objective function)의 값을 최대화하거나 최소화하는 해를 찾는 방법이다. 플럭스 균형 분석에서는 생물체가 최적화하고자 하는 생물학적 목표를 목적 함수로 설정한다. 예를 들어, 세포의 성장을 분석할 때는 생물량(biomass) 생산 속도를 최대로 만드는 것을 목적 함수로 삼는 경우가 많다. 생물량은 세포를 구성하는 아미노산, 핵산, 지질 등 다양한 생체 분자들의 조합으로 표현되며, FBA 모델 내에서는 이러한 전구체들이 모여 새로운 세포 물질을 형성하는 가상의 반응(생물량 반응)으로 나타낸다.

따라서 플럭스 균형 분석 문제는 다음과 같이 요약될 수 있다:
1. 목표 설정: 최대화하려는 생물학적 목표(예: 생물량 생산 속도)를 목적 함수로 정의한다.
2. 제약 조건: 대사 네트워크 내 각 반응의 화학량론적 관계(물질 수지, 즉 정상 상태 가정에 따라 각 대사 물질의 생성 속도와 소모 속도가 같아야 함)와 개별 반응 속도의 상한 및 하한(실험적으로 측정되거나 생화학적 지식에 기반하여 설정)을 제약 조건으로 설정한다.
3. 최적 해 탐색: 주어진 제약 조건들을 모두 만족하면서 목적 함수의 값을 최대로 만드는 각 대사 반응의 속도(플럭스) 분포를 찾는다.

이 최적화 가정 덕분에, 복잡한 효소 동역학 정보나 세포 내 대사 물질의 정확한 농도를 알지 못하더라도, 비교적 쉽게 얻을 수 있는 화학량론 정보만으로 대사 네트워크의 전반적인 작동 방식과 잠재적 성능을 예측할 수 있다는 큰 장점이 있다.

실제로 이 접근법은 원핵생물인 대장균(E. coli)이 다양한 영양 조건에서 얼마나 빠르게 성장할 수 있는지를 상당히 정확하게 예측하는 데 성공했으며, 이는 최적화 가정이 실제 생명 현상을 이해하는 데 유용함을 보여주는 사례이다. 또한, 생물량 생산 외에도 특정 항생제, 아미노산, 바이오 연료 등 생명 공학적으로 유용한 물질의 생산량을 최대화하는 것을 목적 함수로 설정하여, 해당 물질의 생산 효율을 높이기 위한 대사 경로 수정 전략을 탐색하는 데에도 널리 활용되고 있다.

4. 수학적 설명

대사 유체 모델링의 전통적인 접근 방식인 상미분 방정식을 이용한 모델링과 대조적으로, 플럭스 균형 분석(FBA)은 효소 동역학적 매개변수와 시스템 내 대사 물질의 농도에 대한 정보가 훨씬 적게 필요하다. 이는 정상 상태와 최적화라는 두 가지 핵심 가정을 통해 가능하다. 첫 번째 가정은 모델링하는 시스템이 정상 상태에 도달했다는 것으로, 이는 대사 물질의 농도가 더 이상 변하지 않으며 각 대사 물질 노드에서 생성되는 플럭스와 소비되는 플럭스가 서로 상쇄됨을 의미한다. 두 번째 가정은 해당 유기체가 최적 성장이나 자원 보존과 같은 특정 생물학적 목표를 달성하기 위해 진화를 통해 최적화되었다는 것이다. 정상 상태 가정은 시스템을 일련의 선형 방정식으로 단순화시킨다. 이 방정식을 풀어 화학량론적 제약 조건을 만족하면서, 생물량 전구체를 생물량으로 변환하는 것을 나타내는 가상의 반응(목적 함수)의 값을 최대화하는 플럭스 분포를 찾는다.

정상 상태 가정은 생물 공정 공학에서 발효기 내 미생물 세포의 성장을 모델링하기 위해 개발된 물질 수지 개념에서 유래했다. 미생물이 성장하는 동안 기질(탄소, 수소, 산소, 질소 등의 복합 혼합물과 미량 원소)이 소비되어 생물량을 생성한다. 이 과정에 대한 물질 수지 모델은 다음과 같이 표현된다.

: $\mathrm{입력} = \mathrm{출력} + \mathrm{축적}$

미생물 세포 시스템이 정상 상태에 있다고 가정하면, 축적 항은 0이 되므로 물질 수지 방정식은 단순한 대수 방정식으로 줄어든다. 이러한 시스템에서 기질은 시스템으로 입력되어 소비되고, 생물량은 시스템에서 출력으로 생성된다. 따라서 물질 수지는 다음과 같다.

: $\mathrm{입력} = \mathrm{출력}$
: $\mathrm{입력} - \mathrm{출력} = \mathrm{0}$

수학적으로 이 대수 방정식은 계수 행렬과 미지수 벡터의 점 곱으로 나타낼 수 있다. 정상 상태 가정으로 축적 항이 0이 되므로 시스템은 다음과 같이 표현된다.
: $\qquad A \cdot\mathbf{x} = \mathbf{0}$

이 개념을 대사 네트워크에 적용하면, 대사 네트워크를 화학량론적으로 균형 잡힌 일련의 방정식으로 나타낼 수 있다. 이를 행렬 형식으로 변환하여, 화학량론적 계수 행렬(화학량론적 행렬 $S$ )과 미지수인 플럭스 벡터 $\mathbf{v}$ 의 점 곱으로 표현하고, 우변을 0으로 설정하여 정상 상태를 나타낸다.

: $\qquad S \cdot\mathbf{v} = \mathbf{0}$

일반적으로 대사 네트워크는 대사 물질보다 반응의 수가 더 많다. 이는 방정식의 수보다 변수의 수가 더 많은 미결정 선형 방정식 시스템을 형성한다. 이러한 미결정 시스템을 해결하는 표준적인 접근 방식은 선형 계획법(Linear Programming, LP)을 적용하는 것이다.

선형 계획법은 다음과 같은 표준 형식으로 표현될 수 있는 문제이다.
: $\begin{align}& \text{최대화} && \mathbf{c}^\mathrm{T} \mathbf{x}\\& \text{제약 조건} && A \mathbf{x} \leq \mathbf{b} \\& \text{그리고} && \mathbf{x} \ge \mathbf{0}\end{align}$

여기서 x는 결정해야 할 변수 벡터를 나타내고, c와 b는 알려진 계수의 벡터이며, A는 알려진 계수의 행렬이다. $(\cdot)^\mathrm{T}$ 는 행렬 전치를 의미한다. 최대화하거나 최소화할 표현식( $\mathbf{c}^\mathrm{T} \mathbf{x}$ )을 목적 함수라고 한다. 부등식 A x ≤ b는 목적 함수를 최적화할 볼록 다면체를 정의하는 제약 조건이다.

선형 계획법은 목적 함수의 정의를 필요로 한다. LP 문제의 최적 해는 목적 함수의 값을 최대화하거나 최소화하는 해로 간주된다. 플럭스 균형 분석의 경우, LP의 목적 함수 Z는 종종 생물량 생산으로 정의된다. 생물량 생산은 다양한 생물량 전구체를 하나의 단위 생물량으로 변환하는 종합적인 반응으로 시뮬레이션된다.

따라서 플럭스 균형 분석 문제의 표준 형식은 다음과 같다.
: $\begin{align}& \text{최대화} && \mathbf{c}^\mathrm{T} \mathbf{v}\\& \text{제약 조건} && S \mathbf{v} = \mathbf{0} \\& \text{그리고} && \mathbf{하한} \le \mathbf{v} \le \mathbf{상한}\end{align}$

여기서 $\mathbf{v}$ 는 결정해야 할 플럭스 벡터를 나타내고, $S$ 는 알려진 계수의 행렬이다. 최대화하거나 최소화할 표현식( $\mathbf{c}^\mathrm{T} \mathbf{v}$ )은 목적 함수이다. 부등식 $\mathbf{하한} \le \mathbf{v}$ 와 $\mathbf{v} \le \mathbf{상한}$ 은 $S$ 행렬의 각 열에 해당하는 모든 반응에 대한 플럭스의 최소 및 최대 속도를 각각 정의한다. 이 속도들은 실험적으로 결정하여 모델의 예측 정확도를 높이는 데 사용될 수 있으며, 때로는 반응을 통한 플럭스에 제약이 없음을 나타내기 위해 임의로 높은 값으로 설정될 수도 있다.

플럭스 균형 접근 방식의 주요 장점은 대사 물질 농도나 시스템의 효소 동역학에 대한 지식이 필요하지 않다는 점이다. 정상 상태 가정은 대사 물질 농도가 일정하게 유지되는 한, 해당 정보가 필요하지 않게 만든다. 또한 정상 상태에서는 시스템 내 대사 물질 풀의 크기에 변화가 없다고 가정하므로 특정 속도 법칙에 대한 필요성도 사라진다. 오직 화학량론적 계수만으로 특정 목적 함수를 수학적으로 최대화하기에 충분하다.

목적 함수는 시스템의 각 구성 요소가 원하는 산물의 생산에 어떻게 기여하는지를 측정하는 척도이다. 산물 자체는 모델의 목적에 따라 달라지지만, 가장 일반적인 예 중 하나는 총 생물량 연구이다.

5. 시뮬레이션

플럭스 균형 분석(FBA)은 계산 효율성이 높아, 일반적인 규모의 네트워크(약 10,000개 반응)에서 생물량 생산에 대한 최적 플럭스를 계산하는 데 몇 초 정도밖에 걸리지 않는다.

5.1. 유전자/반응 삭제 및 교란 연구

반응 억제: 대장균 FBA 모델에서 산소 유입 감소에 따른 FBA 예측 성장률(y축) 변화.

글리세롤(x축)과 포도당(y축) 유입 플럭스 변화가 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 성장률(표면 높이, 빨간색)에 미치는 영향을 보여주는 3차원 표현형 위상 평면.

글리세롤(x축)과 포도당(y축) 유입 플럭스 변화가 결핵균의 성장률(색상)에 미치는 영향을 보여주는 표현형 위상 평면의 레벨 플롯.

대장균(왼쪽)과 결핵균(오른쪽)에서 서로 다른 하위 시스템에 걸쳐 치명적인 쌍별 반응 삭제의 상관 관계 비교.

FBA는 계산 부담이 적어, 일반적인 네트워크(약 10,000개 반응 규모)에서 생물량 생산 최적 플럭스를 계산하는 데 몇 초 정도만 소요된다. 따라서 단일 컴퓨터 환경에서도 네트워크 내 반응을 삭제하거나 플럭스 제약을 변경했을 때 나타나는 효과를 충분히 모델링할 수 있다.

단일 반응 삭제
대사 네트워크에서 생물량 생산이나 ATP 생산과 같은 특정 목표 함수에 특히 중요한 반응을 찾는 데 자주 사용되는 기법이다. 네트워크 내 각 반응을 순서대로 하나씩 제거하면서 목표 함수를 통해 예측되는 플럭스 변화를 측정한다. 이를 통해 각 반응이 목표 달성에 필수적인지(플럭스가 크게 감소) 혹은 비필수적인지(플럭스 변화가 없거나 미미함)를 분류할 수 있다.

쌍별 반응 삭제
네트워크 내 모든 가능한 반응 쌍을 동시에 제거하여 그 효과를 분석하는 방법이다. 이는 단일 약물이 여러 표적에 작용하거나, 여러 약물을 조합하여 사용하는 다중 표적 치료법을 시뮬레이션하는 데 유용하다. 또한, 쌍별 반응 삭제 연구는 서로 다른 대사 경로 간의 합성 치사(synthetic lethality) 상호작용을 정량화하여, 각 경로가 전체 네트워크의 견고성(robustness)에 얼마나 기여하는지를 평가할 수 있게 해준다.

단일 및 다중 유전자 삭제
유전자와 효소 촉매 반응 사이의 관계는 유전자-단백질-반응식(Gene-Protein-Reaction associations, GPR)이라는 부울식으로 표현된다.
* (유전자 A AND 유전자 B): 유전자 A와 B의 산물이 각각 단백질 복합체의 하위 단위(subunit)를 형성하는 경우이다. 두 유전자 중 하나라도 없으면 해당 반응이 일어나지 않는다.
* (유전자 A OR 유전자 B): 유전자 A와 B의 산물이 서로 동위효소(isoenzyme) 관계인 경우이다. 둘 중 하나의 유전자만 발현되어도 반응이 활성화될 수 있다.
단일 유전자가 반응을 조절하거나, 확산과 같이 유전자와 관련 없는 반응도 존재한다. GPR을 부울식으로 평가하여 특정 유전자의 삭제(knockout) 효과를 예측할 수 있다. 만약 GPR 평가 결과가 '거짓(false)'이면, 해당 반응의 플럭스를 0으로 제한한 후 FBA를 수행하여 유전자 삭제 효과를 시뮬레이션한다. 유전자와 관련 없는 반응은 이 방법으로 삭제를 시뮬레이션할 수 없다.

유전자-단백질-반응 행렬은 유전자와 단백질 간의 연관성을 나타내는 이진 행렬로, GPR 정보가 없을 때 반응 필수성을 유전자 필수성으로 변환하는 데 사용될 수 있다. 이를 통해 질병 표현형을 유발하는 유전자 결함이나 약물 표적이 될 수 있는 필수 단백질/효소를 찾는 데 활용될 수 있다. 그러나 이 행렬은 유전자 간의 부울 관계(AND/OR)를 명시하지 않으므로, GPR 정보가 있을 경우 GPR을 사용하는 것이 더 정확하다.

반응 억제
반응을 완전히 제거하는 대신, 해당 반응의 최대 허용 플럭스를 낮추어 억제 효과를 시뮬레이션할 수 있다. 반응 삭제와 마찬가지로, 플럭스 감소 정도에 따라 적절한 임계값을 설정하여 억제 효과가 치명적인지 비치명적인지를 분류할 수 있다. 임계값 설정은 다소 임의적일 수 있으나, 실제 억제/삭제 실험을 통한 성장률 측정 결과로부터 합리적인 값을 추정할 수 있다.

배지 최적화
표현형 위상 평면 분석(Phenotypic Phase Plane analysis, PhPP)은 성장률을 높이거나 유용한 부산물 분비를 유도하는 최적의 배지 조성을 설계하는 데 사용된다. 이 방법은 다양한 영양분 섭취 제약 조건 조합 하에서 반복적으로 FBA를 수행하여 목표 함수(예: 성장률) 또는 특정 부산물의 플럭스 값을 관찰한다. PhPP를 통해 특정 대사 상태(표현형)를 유도하거나 성장률, 산업적 유용 부산물 생산을 극대화하는 최적의 영양분 조합을 찾을 수 있다. 실제로 여러 박테리아에서 PhPP를 이용한 예측 성장률이 실험 결과와 잘 일치하는 것으로 나타났으며, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 배양을 위한 최소 배지를 정확하게 정의하는 데 사용되기도 했다.

6. 모델 준비 및 개선

대사 모델을 준비하는 핵심 과정은 크게 세 단계로 나눌 수 있다. 첫째, 분석 대상 유기체의 대사 경로 정보를 종합하여 빈틈없는 대사 네트워크를 구축한다. 둘째, 실제 생물학적 환경을 반영하기 위해 영양소 흡수 속도나 효소 반응 속도 등 다양한 제약 조건을 모델에 추가한다. 마지막으로, 모델이 특정 생리적 목표(예: 세포 성장)를 달성하도록 목표 함수를 설정하는데, 이는 주로 바이오매스 함수 형태로 정의된다. 이러한 과정을 통해 플럭스 평형 분석 (FBA) 등 다양한 분석을 수행할 수 있는 기반 모델이 완성된다.

6.1. 대사 네트워크 구축

FBA 준비를 위해 생산물(빨간색) 추가 및 시스템 경계(점선 녹색선)를 넘나드는 영양소(ATP, ADP, BDG, ADG)의 가져오기/내보내기를 보여주는 대사 네트워크 예시

대사 네트워크 모델은 단일 대사 경로에서부터 세포, 조직, 또는 유기체 전체의 대사 활동을 설명하는 데 사용될 수 있다. 플럭스 평형 분석 (FBA)을 수행하기 위한 대사 네트워크의 가장 중요한 요구 사항은 네트워크 내에 '틈(gap)', 즉 누락된 반응이나 연결되지 않은 대사 물질이 없어야 한다는 것이다.

이러한 완전한 네트워크를 구축하는 과정은 매우 복잡하다. 과거에는 연구자가 직접 문헌 정보 등을 바탕으로 대사 반응들을 일일이 확인하고 연결하는 수동 큐레이션(manual curation) 작업이 필수적이었으며, 이 때문에 전체 네트워크를 완성하는 데 몇 달에서 몇 년이 걸리기도 했다. 하지만 최근에는 '갭 채우기(gap-filling)'와 같이 누락된 부분을 예측하고 자동으로 채워주는 방법들이 개발되면서, 네트워크 구축에 필요한 시간을 몇 주 또는 몇 달 수준으로 크게 단축할 수 있게 되었다.

FBA 모델 생성을 위한 다양한 소프트웨어 패키지가 개발되어 사용되고 있다. 주요 예시는 다음과 같다.
* Pathway Tools/MetaFlux
* Simpheny
* MetNetMaker
* COBRApy
* CarveMe
* MIOM
* COBREXA.jl

일반적으로 완성된 대사 네트워크 모델은 다른 소프트웨어와의 호환성 및 추가 분석, 시각화 등을 위해 BioPAX나 SBML과 같은 표준 형식으로 저장되는 경우가 많지만, 이것이 반드시 필수적인 요건은 아니다.

6.2. 제약 조건 추가

플럭스 균형 분석(FBA)의 핵심은 네트워크 내 반응의 플럭스 속도에 제약 조건을 추가하여 특정 값 범위 내에서 유지되도록 하는 것이다. 이를 통해 모델은 실제 대사 과정을 더 정확하게 모사할 수 있다. 이러한 제약 조건은 생물학적 관점에서 두 가지로 나눌 수 있다.

* 경계 제약 조건(Boundary constraints): 영양소의 흡수나 배출 속도를 제한한다. 생물체는 생존을 위해 외부로부터 영양소를 섭취해야 하는데, 이 속도는 영양소의 가용성, 농도, 확산 상수, 그리고 능동 수송이나 촉진 확산과 같은 흡수 방법에 따라 달라진다. 만약 특정 영양소의 흡수 또는 배설 속도를 실험적으로 측정할 수 있다면, 이 값을 모델의 경계 플럭스에 대한 제약 조건으로 추가할 수 있다. 예를 들어, 특정 영양소가 없거나 흡수되지 않는 경우 해당 플럭스 속도를 0으로 제한하여 대사에 들어오지 못하게 막고, 알려진 섭취 속도를 시뮬레이션이 따르도록 강제할 수 있다. 이는 시뮬레이션 결과가 수학적으로 가능할 뿐만 아니라 실험적으로 검증된 특성을 갖도록 보장하는 중요한 방법이다.
* 내부 제약 조건(Internal constraints): 유기체 내부 반응을 통한 플럭스를 제한한다. 이는 주로 반응의 방향성이나 최대 속도에 대한 제약이다.
* 방향성: 원칙적으로 모든 반응은 가역적이지만, 실제로는 반응물 농도가 생성물보다 훨씬 높거나, 생성물의 자유 에너지가 반응물보다 현저히 낮아 열역학적으로 한쪽 방향이 압도적으로 선호되는 경우 반응은 한 방향으로만 진행되는 경우가 많다. 이상적인 반응의 플럭스( $v_i$ )는 $- \infty < v_i < \infty \,$ 범위를 가지지만, 열역학적 제약이 적용되면 특정 방향(예: 정방향)으로만 흐름이 제한될 수 있다( $0 < v_i < \infty \,$ ).
* 최대 속도: 실제 생물 시스템 내 효소의 양은 유한하므로, 반응을 통한 플럭스는 무한대가 될 수 없다. 따라서 최대 속도( $v_\max$ ) 제약이 추가된다( $0 < v_i < v_\max \,$ ).

수학적으로 제약 조건의 적용은 FBA 모델의 해 공간, 즉 가능한 플럭스 분포의 범위를 줄이는 것으로 해석할 수 있다.

또한, 특정 반응의 플럭스 속도를 실험적으로 측정할 수 있다면( $v_{i,m}\,$ ), 이 값을 모델에 직접적인 제약 조건으로 추가할 수도 있다. 모델 내 해당 플럭스( $v_i$ )가 측정값 주변의 작은 오차 범위( $\varepsilon\,$ ) 내에 있도록 강제하여( $v_{i,m} - \varepsilon < v_i), 시뮬레이션이 실험 결과를 정확하게 재현하도록 할 수 있다. 플럭스 속도는 네트워크 경계에서의 영양분 흡수/배출을 측정하는 것이 가장 용이하다. 내부 반응의 플럭스는 방사성 동위원소로 표지된 대사 물질이나 핵자기 공명 (NMR)과 같은 기술을 사용하여 측정할 수 있다.$

6.3. 목적 함수 추가

모델 준비의 핵심 단계 중 하나는 목적 함수를 추가하는 것이다. 이는 일반적으로 모델링 대상 유기체의 특정 생리적 목표, 예를 들어 성장을 시뮬레이션하는 데 사용되며, 흔히 바이오매스 함수라고 불린다.

플럭스 균형 분석(FBA)은 주어진 제약 조건( $\mathbf{S} \vec v = 0$ , 여기서 $\mathbf{S}$ 는 화학량론 행렬, $\vec v$ 는 반응 플럭스 벡터)을 만족하는 다수의 수학적 해를 도출할 수 있다. 목적 함수는 이 해들 중에서 생물학적으로 의미 있는, 즉 원하는 대사 산물을 적절한 비율로 생성하는 해를 식별하는 기준을 제공한다.

유기체의 성장을 모델링할 때, 목적 함수는 주로 바이오매스(biomass)로 정의된다. 수학적으로 이는 화학량론 행렬의 한 열에 해당하며, 이 열의 각 항목은 지방산, 아미노산, 세포벽 구성 요소 등 세포 성장에 필요한 생합성 전구체에 대한 '요구량'을 나타낸다. 이 값들은 실험적으로 측정한 세포 구성 요소의 건조 중량 비율을 반영한다. 따라서 바이오매스 함수는 세포의 성장과 번식을 모사하는 하나의 종합적인 반응처럼 작동한다. 실험 측정의 정확성은 바이오매스 함수를 올바르게 정의하고, FBA 결과가 실제 생명 현상을 잘 반영하도록 하는 데 필수적이다.

연구 대상이 되는 네트워크가 작거나 특정 경로에 초점을 맞출 경우, 목적 함수를 다르게 설정할 수 있다. 예를 들어, 당분해 경로 연구에서는 특정 비율의 아데노신 삼인산(ATP)과 NADH 생성을 목적 함수로 정의하여, 해당 경로를 통한 에너지 대사 산물 생산 효율을 분석할 수 있다.

선형 계획법은 주어진 제약 조건 하에서 목적 함수 값을 최적화(최대화 또는 최소화)하는 단일 해를 찾는 데 사용된다. 전체 유기체 대사 네트워크 모델링에서 가장 일반적인 생물학적 최적화 목표는 바이오매스 함수의 플럭스( $v_\textrm{biomass}$ 또는 $v_b$ )를 최대화하는 것이다. 이는 다음 수식으로 표현된다.

: $\max_{ \vec v}\ v_b \qquad \textrm{조건.} \qquad \mathbf{S} \, \vec v=0$

더 일반적인 접근 방식에서는, 최적화하고자 하는 반응들의 가중치를 나타내는 벡터 $\vec c$ 를 도입하여 목적 함수를 정의할 수 있다.

: $\max_{ \vec v}\ \vec v \cdot \vec c \qquad \textrm{조건.} \qquad \mathbf{S}\,\vec{v}=0.$

만약 단일 바이오매스 함수만을 최적화 목표로 삼는다면, 벡터 $\vec c$ 는 해당 바이오매스 반응에 해당하는 위치의 값만 1(또는 0이 아닌 다른 상수)이고 나머지 모든 값은 0이 된다. 여러 개의 목적 함수를 동시에 고려해야 할 경우, $\vec c$ 는 각 목적 함수에 해당하는 위치에 특정 가중치를 부여하고 나머지 값은 0으로 설정한다.

7. 확장

플럭스 균형 분석(FBA)은 대사 네트워크를 분석하는 데 유용하지만, 몇 가지 한계점을 지니고 있다. 이러한 FBA의 한계를 보완하고 분석의 폭을 넓히기 위해 다양한 확장 기법들이 개발되었다. 대표적인 예로는 플럭스 변동성 분석(FVA), 대사 조정 최소화(MOMA), 조절 On-Off 최소화(ROOM), 동적 FBA(Dynamic FBA) 등이 있으며, 이들은 FBA가 가진 제약을 극복하고 대사 시스템에 대한 더 깊이 있는 이해를 돕는다.

7.1. 플럭스 변동성 분석 (FVA)

플럭스-밸런스 문제의 최적해는 대부분 유일하지 않으며, 동일하게 최적인 여러 가능한 해가 존재한다. 플럭스 변동성 분석(FVA)은 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법 중 하나이다. 일부 분석 소프트웨어에 내장된 FVA는 각 반응을 통해 가능한 플럭스의 범위를 계산하여 그 경계를 제시한다. 이를 통해 다른 플럭스와의 적절한 조합을 고려하여 최적해를 추정할 수 있다.

FVA 분석 결과, 플럭스의 변동성이 낮은 반응은 해당 유기체의 생존이나 기능 유지에 더 중요할 가능성이 높다고 해석할 수 있다. 따라서 FVA는 대사 네트워크 내에서 중요한 반응을 식별하는 데 유용한 기술로 평가받는다.

7.2. 대사 조정 최소화 (MOMA)

플럭스 균형 분석(FBA)은 유전자 녹아웃이나 배지 환경 변화 시 최종적으로 도달하는 정상 상태의 대사 흐름(플럭스) 분포를 예측한다. 하지만 이 최종 상태에 도달하기까지는 다양한 시간이 소요될 수 있다. 예를 들어, 주된 탄소원으로 글리세롤을 사용하는 대장균의 경우, 초기 성장률은 FBA 예측과 달랐지만, 40일 (약 700세대) 동안 배양하면 FBA 예측과 일치하는 수준으로 적응 진화하는 것이 관찰되었다.

때로는 환경 변화나 유전자 녹아웃 같은 교란이 발생한 직후의 즉각적인 효과를 파악하는 것이 중요할 수 있다. 유기체가 조절 메커니즘을 변화시키고 새로운 탄소원을 최적으로 사용하거나 유전자 녹아웃의 영향을 피하기 위해 대사 흐름을 재구성하는 데는 시간이 걸리기 때문이다.

대사 조정 최소화(Minimization of Metabolic Adjustment, MOMA)는 이러한 교란 직후의 즉각적인 하위 최적(sub-optimal) 상태의 플럭스 분포를 예측하는 방법이다. MOMA는 2차 계획법(quadratic programming)을 사용하여, 교란 전의 정상 상태(야생형) 플럭스 분포와 교란 후(돌연변이체) 플럭스 분포 사이의 유클리드 거리를 최소화하는 지점을 찾는다. 이는 유기체가 기존 상태에서 가장 적은 변화로 새로운 환경에 적응하려 할 것이라는 가정에 기반한다.

MOMA는 다음과 같은 형태의 최적화 문제로 표현될 수 있다.

$\min\ ||\mathbf{v_w} - \mathbf{v_d}||^2 \qquad \text{subject to}\quad \mathbf{S}\cdot\mathbf{v_d}=0$

여기서 $\mathbf{v_w}$ 는 야생형(교란 전) 플럭스 분포를, $\mathbf{v_d}$ 는 예측하려는 돌연변이(교란 후) 플럭스 분포를 나타낸다. $\mathbf{S}$ 는 화학양론적 행렬이다. 이 식은 아래와 같이 단순화될 수 있다.

$\min\ \frac{1}{2}\,{\mathbf{v_d}}^T\,\mathbf{I}\,\mathbf{v_d} + (\mathbf{-v_w})\cdot\mathbf{v_d} \qquad \text{subject to}\quad \mathbf{S}\cdot\mathbf{v_d}=0$

이 최적화 문제의 해답( $\mathbf{v_d}$ )이 바로 MOMA가 예측하는 교란 직후의 플럭스 분포이다.

7.3. 조절 On-Off 최소화 (ROOM)

조절 On-Off 최소화 (Regulatory On-Off Minimization, ROOM)는 유전자 제거 후 유기체의 대사 상태를 예측하는 방법 중 하나이다. 이는 MOMA (최소 대사 조정 방법)와 같이, 유기체가 유전자 제거 후 야생형 상태와 최대한 유사한 대사 플럭스 분포를 가지려고 한다는 기본 가정을 공유한다.

그러나 ROOM은 여기서 한 걸음 더 나아가, 유기체가 새로운 정상 상태에 도달하는 과정에서 유전자 조절 네트워크에 의한 일련의 과도기적 대사 변화를 겪으며, 이 과정에서 필요한 조절 변화(유전자 발현의 '켜짐' 또는 '꺼짐')의 횟수를 최소화하려 한다는 가설을 세운다. 즉, 가능한 한 기존의 조절 상태를 유지하려는 경향을 반영하는 것이다. MOMA가 거리 측정 최소화 방식을 사용하는 것과 달리, ROOM은 혼합 정수 계획법 (Mixed Integer Linear Programming, MILP)을 사용하여 이러한 최소 조절 변화를 가지는 대사 플럭스 분포를 계산한다.

7.4. 동적 FBA (Dynamic FBA)

동적 FBA는 모델이 시간에 따라 변화하는 기능을 추가하여, 순수한 FBA의 엄격한 정상 상태 조건을 어느 정도 피하려는 시도이다. 일반적으로 이 기술은 FBA 시뮬레이션을 실행하고, 해당 시뮬레이션의 결과를 바탕으로 모델을 변경한 다음, 시뮬레이션을 다시 실행하는 방식으로 이루어진다. 이 과정을 반복함으로써 시간에 따른 피드백 요소를 얻을 수 있다.

8. 다른 기술과의 비교

플럭스 균형 분석(FBA)은 다른 대사 분석 기술들과 비교했을 때 고유한 특징을 가진다. 병목 지점 분석보다는 더 정교한 분석 결과를 제공하며, 완전한 동적 대사 시뮬레이션에 비해 반응 속도 정보는 적지만 모델 구축에 필요한 네트워크 재구성은 훨씬 덜 복잡하다. 이러한 중간적인 특성 덕분에 FBA는 세포 시스템의 전체적인 대사 능력을 분석하는 데 매우 유용한 기술로 활용된다.

8.1. 병목 지점 분석 (Choke Point Analysis)

병목 지점 분석(Choke Point Analysis)은 대사 산물이 생성되거나 소비되기만 하는 지점, 즉 '병목 지점'을 중심으로 분석하는 방법이다. 이 분석법은 대사 네트워크 내의 각 반응을 개별적으로 고려한다. 따라서 네트워크 전체를 하나의 완전체(계량 행렬)로 보고 네트워크 효과까지 모델링하는 플럭스 균형 분석(FBA)과는 차이가 있다. 병목 지점 분석은 서로 영향을 미치는 멀리 떨어진 경로의 화학 반응과 같은 네트워크 효과를 시뮬레이션하기는 어렵다는 단점이 있다. 하지만 네트워크가 매우 파편화되어 있거나 정보가 부족한 경우에도 중요한 반응을 찾아낼 수 있다는 장점을 가진다. 반면, FBA는 병목 지점 분석보다 더 정교한 분석을 제공하며, 세포 시스템의 전체적인 대사 능력을 분석하는 데 유용하게 사용된다.

8.2. 동적 대사 시뮬레이션 (Dynamic Metabolic Simulation)

플럭스 균형 분석 (FBA)은 시스템 내 대사 산물의 내부 농도가 시간에 따라 일정하게 유지된다고 가정하는 정상 상태 분석 방법이다. 반면, 동적 대사 시뮬레이션은 시간에 따른 시스템 변화를 고려하므로, 정상 상태 해답만 제공하는 FBA와 달리 시간에 따른 변화를 포함한 결과를 얻을 수 있다. 예를 들어, 시간에 따라 상태가 변하는 신경 세포의 기능을 분석하는 데에는 동적 시뮬레이션이 FBA보다 더 적합할 수 있다.

FBA는 모델 내에서 대사 산물의 내부 농도를 직접 고려하지 않아, 때때로 생물학적으로 비현실적인 수준의 높은 대사 산물 농도를 포함하는 해답을 도출할 가능성이 있다. 동적 대사 시뮬레이션은 이러한 내부 농도 변화를 추적하므로 이러한 문제를 피하는 데 유리하다.

하지만 동적 대사 시뮬레이션은 FBA에 비해 계산 비용이 훨씬 많이 들고, 효소 역학과 같이 효소의 속도 및 복잡한 상호 작용에 대한 정보를 모델에 포함해야 하므로 모델 구축 및 재구성 과정이 더 복잡하다는 단점이 있다. FBA는 이러한 복잡성을 줄여 상대적으로 계산 비용이 적게 들고 모델을 단순화할 수 있다는 장점을 가진다.

9. 응용 분야 (한국의 관점)

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