변성 구배 젤 전기영동
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1. 개요
변성 구배 젤 전기영동(DGGE)은 DNA의 염기 서열 차이를 분리하는 데 사용되는 분자 생물학 기술이다. DGGE는 변성제 농도 구배가 있는 젤을 사용하며, 온도 구배 젤 전기영동(TGGE)은 온도 구배를 사용하여 DNA를 분리한다. 이 기술은 미생물 군집 분석, 돌연변이 검출 등 다양한 분야에 활용되며, CDGE와 같은 변형된 방법도 존재한다.
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| 변성 구배 젤 전기영동 | |
|---|---|
| 일반 정보 | |
| 방법 종류 | 분리 방법 |
| 분석 종류 | DNA 분석 |
| 관련 항목 | 전기 영동 PCR DNA RNA 단백질 |
| 원리 | |
| 변성 구배 젤 전기 영동 (DGGE) | DNA 단편의 염기 서열에 따른 이동성 차이를 이용한 분리 방법 |
| 온도 구배 젤 전기 영동 (TGGE) | 온도 구배를 사용하여 DNA를 변성시키는 방법 |
| 기본 원리 | DNA가 변성됨에 따라 젤 내에서 이동성이 감소하는 현상 이용 |
| 특징 | |
| 변성제 종류 | 요소 포름아마이드 |
| 변성제 농도 | 0%에서 100%까지의 구배를 가짐 |
| 응용 | 미생물 군집 분석 유전자 변이 검출 진단 |
| 과정 | |
| 1단계 | PCR을 이용한 DNA 단편 증폭 |
| 2단계 | 변성 구배 젤 전기 영동 수행 |
| 3단계 | 젤 염색 및 DNA 밴드 확인 |
| 4단계 | DNA 밴드 절단 및 염기 서열 분석 |
| 주의사항 | |
| PCR | PCR 과정에서 키메라 생성 가능성 존재 |
| 젤 조건 | 젤의 온도 및 변성제 구배 조건 최적화 필요 |
2. 역사
변성 구배 젤 전기영동(DGGE)은 레너드 레르만이 SUNY 올버니의 교수로 재직하던 시절에 발명했다.[1][2][3] 동일한 장비를 사용하여 단백질 분석을 할 수 있으며, 이는 영국 케임브리지에 있는 MRC 분자생물학 연구소의 토마스 E. 크레이튼이 처음 수행했다.[4]
DNA는 음전하를 띠고 있어 전기장 내에서 양극(+) 방향으로 이동한다. 전기영동에 사용되는 폴리아크릴아마이드 젤과 같은 젤은 분자 수준의 그물 구조를 가지고 있어, DNA 분자가 이동할 때 크기가 작을수록 더 빠르게 통과한다. 이것이 일반적인 전기 영동에서 DNA를 크기별로 분리하는 기본 원리이다.
온도 구배 젤 전기영동(TGGE)은 태처와 홋슨[5] 및 조지아 공과대학교의 로저 와텔에 의해 처음 기술되었다. 이후 독일의 리스너 그룹에서 광범위한 연구를 수행했다. 현재 DGGE 상용 장비는 Bio-Rad, INGENY 및 CBS Scientific에서 판매하고 있으며, TGGE 시스템은 Biometra에서 판매하고 있다.
3. 원리
변성 구배 젤 전기영동(DGGE 및 TGGE)은 이러한 기본 원리에 더해 DNA 이중 나선 구조가 특정 조건에서 풀리는 현상, 즉 변성 원리를 이용한다. DNA는 특정 온도나 특정 농도의 화학 물질(요소, 포름아미드 등 변성제)에 노출되면 안정적인 이중 나선 구조가 풀리기 시작하여(용융) 부분적으로 단일 가닥 형태로 변한다. 이렇게 변성된 DNA는 구조가 풀리면서 젤의 그물 구조에 더 잘 걸리게 되어 이동 속도가 급격히 느려진다.
이 기술의 핵심은 DNA가 변성되는 조건(온도 또는 변성제 농도)이 DNA의 염기 서열에 따라 다르다는 점이다. 특히, 구아닌(G)과 시토신(C) 염기쌍(GC 쌍)은 아데닌(A)과 티민(T) 염기쌍(AT 쌍)보다 더 안정적이어서 더 높은 온도나 더 높은 농도의 변성제가 필요하다. 이는 GC 염기쌍 사이에는 3개의 수소 결합이 존재하고 염기 간의 쌓임 상호작용(stacking interaction)이 더 강한 반면, AT 염기쌍 사이에는 2개의 수소 결합만 존재하기 때문이다.
따라서 변성 구배 젤 전기영동에서는 젤 내에 변성제의 농도 구배(DGGE) 또는 온도 구배(TGGE)를 만들어 준다. DNA 조각이 전기영동으로 이동하면서 점차 강한 변성 조건에 노출되면, 각자의 염기 서열에 따른 특정 지점에서 변성이 일어나 이동 속도가 느려지게 된다. 이 때문에 분자의 크기(길이)가 같더라도 염기 서열이 다르면 젤 상의 다른 위치에 멈추게 되어 분리가 가능해진다. 이는 DNA 분자를 분리하기 위한 ''"서열 의존적, 크기 독립적 방법"''을 제공하며, 같은 길이의 DNA 조각에서도 미세한 서열 차이나 돌연변이, 다형성 등을 구별할 수 있게 한다.
3. 1. DGGE
이 방법은 변성제의 농도 구배가 있는 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 이중가닥 DNA를 전기영동하는 기술이다. 주로 요소와 포름아미드가 변성제로 사용된다. 젤 내 변성제 농도 구배는 DNA 분자량 차이뿐만 아니라, 염기 서열에 따른 변성 용이성의 차이에 따라 밴드 위치를 다르게 하여 높은 분리능을 제공한다.
DGGE 기술은 작은 DNA(또는 RNA) 샘플을 변성 물질이 포함된 전기영동 젤에 적용하여 작동한다. DNA는 특정 변성 조건에서 용융되어 최대 200-700 염기쌍 크기의 작은 조각까지 분석할 수 있다. DNA가 점점 더 강한 변성 조건에 노출되면, 이중 나선 구조가 부분적으로 풀리며(용융되며) 단일 가닥 형태로 변한다. 변성된 DNA는 젤 내에서 이동 속도가 느려지기 때문에, 이중가닥 DNA가 변성되는 지점 근처에 밴드가 나타난다.
DNA의 용융 과정은 단계적으로 일어나며, DNA 서열의 특정 부분(도메인)은 매우 좁은 범위의 변성 조건 내에서 갑자기 단일 가닥이 된다. 이 때문에 염기 서열이 약간 다른 DNA 조각이라도 서로 다른 위치에서 용융되어 젤 상의 다른 지점에 멈추게 된다. 이를 통해 같은 길이의 DNA 조각에서도 서열 차이나 돌연변이, 다형성을 구별할 수 있다. 젤에 두 개의 샘플을 나란히 놓고 함께 변성시키면 연구자들은 두 샘플 또는 DNA 조각의 작은 차이점까지 쉽게 확인할 수 있다.
초기 DGGE 방법으로는 G-C 염기쌍 비율이 높은 이중가닥 DNA의 미스매치를 충분히 검출하기 어려웠다. 이를 해결하기 위해 GC 클램프(GC clamp)라는 약 40 염기쌍 길이의 G-C가 풍부한 서열을 PCR 시 한쪽 프라이머의 5' 말단에 부착하는 방법이 개발되었다. GC 클램프는 DNA 조각의 한쪽 끝이 쉽게 변성되지 않도록 안정화시켜, 나머지 부분의 미세한 염기 서열 차이에 따른 용융점 차이를 더 명확하게 드러낸다. 이로 인해 분리능이 향상되고, G-C 비율이 높거나 더 긴 DNA 단편 분석도 가능해진다. 하지만 GC 클램프가 부착된 프라이머는 일반 프라이머보다 길어(약 60 염기쌍)지고 구조가 복잡하여 가격이 비싸다는 단점이 있다.
DGGE는 화학적 변성제 구배를 사용하는데, 이는 재현성 있게 만들기가 어렵고, 때로는 이중가닥 DNA를 완전히 분리하지 못하는 경우가 있다. 이러한 문제는 온도 구배를 이용하는 TGGE(Temperature Gradient Gel Electrophoresis)로 일부 해결될 수 있다.
DGGE 실험 과정은 다음과 같은 주요 단계로 이루어진다.3. 2. TGGE
TGGE(Temperature Gradient Gel Electrophoresis, 온도구배젤전기영동법)는 변성제를 사용하는 대신 온도 구배를 이용하여 DNA를 분리하는 전기 영동 방법이다.
DNA는 기본적으로 음전하를 띠고 있어 전기장 속에서 양극(+) 방향으로 이동한다. 전기 영동에 사용되는 젤은 미세한 그물 구조를 가지고 있어, DNA 분자가 이 젤을 통과할 때 크기가 작을수록 더 빠르게 이동한다. 이것이 일반적인 전기 영동에서 DNA를 크기별로 분리하는 원리이다.
TGGE에서는 이러한 기본적인 원리에 더하여 젤 전체에 걸쳐 온도를 점진적으로 변화시키는 온도 구배를 적용한다. DNA는 상온에서는 안정적인 이중 나선 구조를 유지하지만, 온도가 특정 수준 이상으로 올라가면 두 가닥이 분리되기 시작하는데, 이를 용융이라고 한다. DNA가 용융되면 구조가 변하면서 젤을 통과하는 속도가 급격히 느려진다.
핵심적인 원리는 DNA가 용융되는 온도가 염기 서열에 따라 달라진다는 점이다. 예를 들어, 구아닌(G)과 시토신(C) 염기쌍은 아데닌(A)과 티민(T) 염기쌍보다 더 강한 결합(3개의 수소 결합을 가지는 반면, 후자는 2개만 가짐)을 가지고 있어 더 높은 온도에서 분리된다. 이러한 서열의 차이 때문에 염기 서열이 다른 DNA 분자들은 서로 다른 온도 지점에서 용융되어 이동 속도가 달라지게 되고, 결과적으로 젤 상의 다른 위치에 멈추게 된다.
따라서 TGGE는 DNA 분자의 크기와는 관계없이 염기 서열의 미세한 차이를 감지하여 분리할 수 있는 서열 의존적, 크기 독립적 방법이다. 이 방법을 통해 DNA 분자를 분리할 뿐만 아니라, 각 분자의 용융 특성 및 열적 안정성에 대한 정보도 얻을 수 있다(Biometra, 2000). 이는 특정 유전자의 변이를 탐지하거나 미생물 군집 분석 등에 활용될 수 있다.
4. 단계
변성 구배 젤 전기영동(DGGE) 및 온도 구배 젤 전기영동(TGGE) 분석은 일반적으로 다음과 같은 단계로 진행된다.
# 분석하고자 하는 DNA 영역을 증폭시키기 위한 프라이머를 설계한다.
# DGGE의 경우 변성제 농도 구배를, TGGE의 경우 온도 구배를 갖는 젤을 제작한다. 제작된 젤은 사용 전 적절한 완충 용액에서 사전 전기영동(프리런) 과정을 거치기도 한다.
# 준비된 젤에 분석할 샘플을 넣고 전압을 걸어 전기영동을 수행하여 DNA 단편들을 분리한다.
# 전기영동이 끝난 젤을 염색하여 분리된 DNA 밴드를 시각화한다.
# 필요한 경우, 특정 DNA 밴드를 젤에서 잘라내어 DNA를 추출하고, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 후 염기서열 분석(시퀀싱) 등을 통해 추가적인 분석을 수행한다.[6]
4. 1. 프라이머 디자인
변성 구배 젤 전기영동(DGGE)에서는 분석하고자 하는 DNA 영역을 증폭시키기 위해 해당 영역에 특이적인 프라이머를 설계해야 한다. 특히 DGGE 기법에서는 분리능을 향상시키기 위해 프라이머에 GC 클램프(GC clamp)라고 불리는 특별한 서열을 추가하는 경우가 많다.[1]GC 클램프는 구아닌(G)과 사이토신(C) 염기가 풍부하여 안정적인 약 40염기쌍 길이의 DNA 서열이다. 이는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 과정에서 사용하는 한쪽 프라이머의 5' 말단에 부착된다. 이 GC 클램프는 전기영동 중 DNA 이중가닥이 변성될 때, 가장 먼저 변성되는 불안정한 영역이 분리되더라도 나머지 부분이 완전히 풀어지지 않도록 잡아주는 역할을 한다. 이로 인해 DNA 단편들이 녹는점 차이에 따라 더 명확하게 분리되어 분리능이 향상된다. 또한, GC 클램프를 사용하면 상대적으로 길이가 길거나 GC 함량이 높은 DNA 단편도 효과적으로 분석할 수 있다.[1]
GC 클램프를 포함하는 프라이머를 설계할 때는 증폭될 DNA 단편(일반적으로 100~400 염기쌍) 내에서 변성되는 영역(melting domain)이 하나 또는 최대 두 개가 되도록 고려한다. 그리고 GC 클램프는 이 중에서 가장 쉽게 변성되는 영역에 가깝게 위치하도록 설계하는 것이 일반적이다.[1]
하지만 GC 클램프가 부착된 프라이머는 일반적인 프라이머(약 20 염기쌍)에 비해 전체 길이가 약 60 염기쌍 정도로 길어지기 때문에, 제작 비용이 더 높다는 단점이 있다.[1]
4. 2. 농도 구배 젤 또는 온도 구배 젤 만들기
DGGE의 경우, 변성제의 농도 구배가 있는 폴리아크릴아마이드 젤을 만든다. 이때, 전기영동 진행 방향을 향해 요소나 포름아미드 같은 변성제의 농도가 높아지도록 설정한다. 이렇게 농도 구배를 만들면, 이중가닥 DNA는 분자량 차이뿐만 아니라 변성되는 정도의 차이에 따라서 이동 속도가 달라져 높은 분리능을 얻는다. 젤을 만든 후에는 일정한 온도로 데운 TAE 완충 용액에서 15분 정도 사전 전기영동(프리런)을 수행한다.TGGE의 경우, 젤 전체에 걸쳐 온도 구배를 설정하여 핵산을 분리한다. 젤을 준비할 때는 온도가 증가하는 환경에서도 안정적으로 유지될 수 있는 완충 용액 시스템을 선택하는 것이 중요하다. 이를 위해 일반적으로 요소를 사용하는데, 사용하는 요소의 양이 DNA 분리에 필요한 전체 온도에 영향을 미친다는 점을 고려해야 한다.[6]
4. 3. 전기 영동
샘플을 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후, 일정 전압으로 전기영동을 수행한다. TGGE(온도 구배 젤 전기영동)의 경우, 사용하는 젤의 유형(수직 또는 평행)에 따라 시료를 준비하고 로딩하는 방식이 다르다. 수직 TGGE는 한 종류의 시료를 비교적 많은 양으로 사용하고, 평행 TGGE는 여러 종류의 시료를 적은 양으로 로딩하여 동시에 분석하는 데 유리하다.[6] DNA 조각들의 분리능을 높이기 위해서는 낮은 전압(일반적으로 50~60V 정도)에서 장시간(예: 하룻밤) 동안 전기 영동을 진행하는 경우가 많다.4. 4. 염색
전기영동이 끝난 젤은 DNA 밴드를 눈으로 확인할 수 있도록 염색 과정을 거친다. 일반적으로 에티듐 브로마이드(EtBr)가 염색 시약으로 사용되며, 이보다 감도가 더 높은 SYBR Gold나 SYBR Green I 같은 시약들도 이용된다. 온도 구배 젤 전기영동(TGGE)에서는 은염색이 효과적인 방법으로 사용되기도 한다.[6]4. 5. 밴드 잘라내기 및 분석 (선택 사항)
전기영동 후 특정 DNA 밴드가 나타나면, 이 밴드를 잘라내어 분석하는 과정을 추가로 진행할 수 있다. 결과 젤에서는 밴드가 매우 얇고 서로 밀집되어 나타나는 경우가 많으므로, 밴드를 잘라낼 때는 보통 멸균된 파스퇴르 피펫이나 피펫 팁을 사용한다.[6]잘라낸 젤 조각에서는 완충 용액(예: TAE 완충액) 등을 이용하여 DNA를 분리해낸다(용출).[6] 이렇게 얻은 DNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시킨 후, 염기서열 분석을 수행하여 해당 DNA의 염기 서열 정보를 확인할 수 있다.[6]
만약 젤에서 밴드가 명확하게 분리되지 않아 특정 밴드만을 깨끗하게 잘라내기 어려운 경우, 즉 복잡한 미생물 군집 등을 분석할 때는 TA 클로닝과 같은 다른 분자생물학적 기법을 함께 사용하여 분석의 정확도를 높일 수 있다.
5. 활용
변성 구배 젤 전기영동(DGGE) 및 온도 구배 젤 전기영동(TGGE)은 본래 피셔(Fisher)와 러만(Lerman)이 1983년에 이중가닥 DNA 염기서열의 미세한 차이를 비교적 쉽게 검출하기 위해 제안한 기법이다. 그러나 이 기법들은 높은 분리능을 바탕으로 미생물 군집 분석(메타게놈 분석) 등 다양한 분야로 응용 범위가 넓어졌다.
현재 DGGE와 TGGE는 생의학 연구 및 생태학 연구에서 광범위하게 활용되고 있다.
5. 1. 미생물 군집 분석 (메타게놈 분석)
변성 구배 젤 전기영동(DGGE)과 온도 구배 젤 전기영동(TGGE)은 본래 DNA 이중가닥의 염기서열 차이를 비교적 쉽게 검출하기 위해 피셔(Fisher)와 러만(Lerman)이 1983년에 제안한 방법이다. 하지만 높은 분리능 덕분에 미생물 군집 분석(메타게놈 분석)에도 널리 응용되고 있다.환경 속 미생물 군집은 수많은 종을 포함하며, 대부분은 실험실 배양이 어렵다. DGGE/TGGE는 이러한 미생물들을 배양 과정 없이 한 번에 검출할 수 있는 중요한 분석 도구 중 하나이다. 복잡한 미생물 군집에서 추출한 DNA를 세균과 고세균의 16S rRNA 유전자 또는 진핵생물의 18S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하면, 다양한 미생물로부터 유래한 PCR 산물의 혼합물이 만들어진다. 이 증폭 산물들은 길이가 거의 동일하여 일반적인 아가로스 젤 전기영동으로는 분리하기 어렵다. 그러나 각 미생물의 rRNA 유전자 서열 차이(특히 GC 함량 및 분포)는 해당 DNA 분자가 변성되는 조건에 차이를 유발한다. DGGE/TGGE는 이러한 변성 조건의 차이를 이용하여 DNA 조각들을 분리한다.
이렇게 분리된 밴드 패턴은 미생물 유전 다양성을 시각적으로 보여주며, 군집 내 우세한 종의 상대적인 양을 추정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 분석 방식을 군집 지문법(community fingerprinting)이라고도 부른다. 잘 분리된 밴드에서 DNA를 추출하여 염기서열을 분석하면 해당 미생물 종을 동정하는 데 유용하다.
하지만 복잡한 미생물 군집 DNA를 PCR 증폭하는 과정에서 몇 가지 문제점이 발생할 수 있다. 서로 다른 DNA 서열이 섞여 증폭되는 키메라(chimera) 산물이 생성되거나, DNA 폴리머레이즈의 증폭 오류로 인해 실제와 다른 미생물 종으로 잘못 판단될 가능성이 있다. 이러한 오류를 줄이기 위해 증폭 오류가 적은 φ29DNA폴리머레이즈를 이용한 예비 증폭, 3'→5' 교정 활성이 있는 DNA폴리머리이즈 사용, S1 뉴클리아제(nuclease)를 이용한 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 검출, 키메라체크프로그램을 이용한 서열 검증 등의 방법을 함께 사용하기도 한다.
DGGE 기법을 리보솜 소단위체 유전자에 처음 적용하여 미생물 생태학 연구에 널리 활용될 수 있도록 한 사람은 헤라르트 머이저(Gerard Muyzer)이다. 그는 라이덴 대학교에서 박사후 연구원으로 재직하던 시절 이 연구를 수행했다.[9]
최근에는 16S/18S rRNA 유전자뿐만 아니라 특정 기능을 수행하는 유전자(예: 황 환원, 질소 고정, 암모늄 산화 관련 유전자)를 표적으로 DGGE 분석을 수행하여, 미생물 군집의 기능적 다양성과 계통 발생 정보를 동시에 얻으려는 연구도 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 타바타바에이(Tabatabaei) 연구팀은 2009년 DGGE를 이용하여 팜유 공장 폐수(POME)의 혐기성 소화 과정 중 미생물 군집 구조 변화를 처음으로 규명했다.[10] 이처럼 DGGE/TGGE는 갯벌, 해양, 토양 등 다양한 환경 시료 내 복잡한 미생물 군집의 구조와 다양성을 이해하는 데 효과적인 도구로 사용되고 있다.
5. 2. 돌연변이 검출
웡(Wong), 량(Liang), 권(Kwon), 바이(Bai), 알퍼(Alper), 그롭만(Gropman)의 연구에 따르면,[7] TGGE는 개인의 미토콘드리아 DNA를 검사하는 데 활용될 수 있다. 이 연구에서는 TGGE를 사용하여 미토콘드리아 유전자체에서 두 가지 새로운 돌연변이를 찾아냈다. 연구진은 "미토콘드리아 세포병증이 의심되었지만 일반적인 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 점 돌연변이와 결실 검사에서 음성 반응을 보인 21세 여성의 경우, 온도 구배 젤 전기영동(TGGE)을 통해 전체 미토콘드리아 유전자체에서 알려지지 않은 돌연변이를 선별했다"고 밝혔다.[8]또한, 로어(Lohr) 등(2001)은 췌장 암종이 없는 사람들의 췌장 분비물을 종합적으로 연구한 결과, 일부 참가자의 췌액에서 p53 유전자 변이를 발견했다고 보고했다. p53 변이는 췌장 암종 환자에게서 흔히 발견되기 때문에, 연구진은 이 변이 자체가 췌장암 발병과 관련이 있는지 확인하고자 했다. 로어는 TGGE를 통해 몇몇 참가자에게서 p53 변이를 발견했지만, 이들 중 누구도 췌장 암종으로 발전하지는 않았다. 따라서 연구진은 p53 변이가 췌장 암종 발병의 유일한 지표는 아닐 수 있다는 결론을 내렸다.
6. 변법
변성 구배 젤 전기영동에는 여러 변형된 방법이 존재한다.
- '''TGGE'''(Temperature Gradient Gel Electrophoresis|온도 구배 젤 전기영동eng): 변성제를 사용하는 대신 온도 구배를 이용하여 DNA 단편을 분리하는 방법이다.
- '''CDGE'''(Constant Denaturant Gel Electrophoresis|일정 변성제 젤 전기영동eng): 농도 구배 없이 일정한 농도의 변성제를 사용하여 전기영동을 수행하는 방법이다. 알려진 유전자 변이의 유무를 판별하는 데 용이하며, 자세한 내용은 해당 하위 섹션에서 다룬다.
6. 1. CDGE (Constant Denaturant Gel Electrophoresis, 일정 변성제 젤 전기영동)
CDGE(Constant Denaturant Gel Electrophoresis|일정 변성제 젤 전기영동eng)는 DNA 분리 기법 중 하나로, 변성제의 농도 구배 없이 일정한 농도의 변성제를 포함한 젤을 사용하여 전기영동을 수행한다.[1][2] 이 방법은 이미 알려진 특정 유전자 변이의 유무를 판정하는 데 간편하고 유용하게 사용된다.[1][2]7. 한계점
복잡한 미생물 군집에서 유래하는 DNA를 PCR로 증폭하는 과정에서 몇 가지 문제점이 발생할 수 있다. 증폭 과정 중에 원래의 샘플에는 없던 염기서열 조합인 키메라 산물이 생성될 가능성이 있다. 또한, DNA 중합효소가 DNA를 복제하면서 발생시키는 증폭 오류 때문에 실제와 다른 염기서열 정보가 생성되어, 결과적으로 잘못된 미생물 종으로 동정될 가능성이 있다. 이러한 PCR 증폭 단계에서의 오류는 분석 결과의 정확성에 영향을 미칠 수 있는 한계점으로 작용할 수 있다.
참조
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