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유세포 분석

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목차

1. 개요

유세포 분석은 세포의 물리적 및 화학적 특성을 분석하고 측정하는 데 사용되는 기술이다. 1953년 임피던스 기반 유세포 분석기가 개발된 이후, 형광 기반 유세포 분석기, FACS(형광 활성화 세포 분류) 기술이 개발되었다. 유세포 분석기는 세포의 크기, 모양, 내부 구조, 형광 염료로 표지된 특정 단백질의 존재 여부 등 다양한 요소를 측정할 수 있으며, 세포 분류 기능도 갖추고 있다. 이 기술은 면역학, 종양학, 유전학, 해양 생물학 등 다양한 분야에서 활용되며, 세포 생물학 연구, 질병 진단, 치료 효과 평가 등에 기여한다.

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유세포 분석
개요
명칭유세포 분석
원어 명칭flow cytometry
분류세포 계수법
상세 정보
분석 대상세포 또는 입자
관련 기술쿨터 카운터

2. 역사

월러스 H. 쿨터가 1953년에 임피던스 기반 유세포 분석기를 최초로 특허 등록하면서 유세포 분석 기술의 기반을 마련했다.[6] 1965년, 맥 풀와일러는 세포 분류기를 개발하여 특정 세포 집단을 분리하는 기술을 발전시켰다.[7]

1968년, 뮌스터 대학교의 볼프강 괴데는 형광 기반 유세포 분석기(ICP 11)를 개발했고, 같은 해 12월 18일에 특허를 출원했다.[8] 1969년, 이 분석기는 독일 개발자이자 제조업체인 파르텍이 괴팅겐의 Phywe AG를 통해 최초로 상용화하면서 형광 표지 기술을 활용한 세포 분석이 가능해졌다. 당시에는 흡수 방식이 형광 방식보다 더 선호되기도 했다.[9]

이후, Bio/Physics Systems Inc.(나중: Ortho Diagnostics)의 Cytofluorograph (1971), Partec의 PAS 8000 (1973), Becton Dickinson의 최초의 FACS(형광 활성화 세포 분류) 장치 (1974), Partec/Phywe의 ICP 22 (1975), 쿨터 공사(Coulter Corporation)의 Epics (1977/78) 등 다양한 유세포 분석 장치가 개발되었다.

1970년대에는 레너드 허젠버그 등이 형광 활성화 세포 분류기(FACS)와 단일 클론항체를 이용한 세포 분석 기술을 개발하여 면역학 연구에 크게 기여했다.

1976년, 펜사콜라(플로리다)에서 열린 제5회 미국 엔지니어링 재단 자동 세포학 컨퍼런스에서 "유세포 분석"이라는 용어가 일반적으로 사용하기로 합의되었고, 이 용어는 빠르게 대중화되었다.[10]

3. 유세포 분석기의 구성 및 작동 원리

흐름 세포 계측기의 개략도, 시스 집중에서 데이터 수집까지


현대식 유세포 분석기는 초당 수천 개의 입자를 "실시간"으로 분석할 수 있으며, 세포 분류기로 구성된 경우, 지정된 광학적 특성을 가진 입자를 비슷한 속도로 능동적으로 분리하고 격리할 수 있다. 유세포 분석기는 현미경과 유사하지만, 세포의 이미지를 생성하는 대신, 세포별로 지정된 광학적 매개변수의 고속 처리, 자동화된 정량화를 제공한다. 고체 생물학적 조직을 분석하려면 먼저 단일 세포 현탁액을 준비해야 한다.

유세포 분석기는 흐름 셀, 측정 시스템, 검출기, 증폭 시스템, 그리고 신호 분석을 위한 컴퓨터의 5가지 주요 구성 요소를 갖추고 있다.

  • 흐름 셀은 액체 흐름(시스 유체)을 가지며, 이 액체 흐름은 세포를 운반하고 정렬하여 감지를 위해 빛 빔을 통해 일렬로 통과시킨다.
  • 측정 시스템은 일반적으로 임피던스(또는 전도율) 및 광학 시스템의 측정을 사용하며, 광학 시스템에는 램프(수은, 제논), 고출력 수냉식 레이저(아르곤, 크립톤, 염료 레이저), 저출력 공랭식 레이저(아르곤(488 nm), 적색-HeNe(633 nm), 녹색-HeNe, HeCd(UV)), 다이오드 레이저(파란색, 녹색, 빨간색, 보라색)가 포함되어 빛 신호를 생성한다.
  • 검출기 및 아날로그-디지털 변환(ADC) 시스템은 전방 산란광(FSC) 및 측면 산란광(SSC)뿐만 아니라 염료 특이적 형광 신호의 아날로그 측정을 컴퓨터에서 처리할 수 있는 디지털 신호로 변환한다.
  • 증폭 시스템은 선형 또는 로그일 수 있다.


유세포 분석기를 사용하여 샘플에서 데이터를 수집하는 과정을 "수집"이라고 한다. 수집은 유세포 분석기에 물리적으로 연결된 컴퓨터와 세포 계측기와의 디지털 인터페이스를 처리하는 소프트웨어에 의해 중재된다. 이 소프트웨어는 테스트 중인 샘플에 대한 매개변수(예: 전압, 보상)를 조정할 수 있으며, 샘플 데이터를 수집하는 동안 초기 샘플 정보를 표시하여 매개변수가 올바르게 설정되었는지 확인하는 데 도움을 준다.

초기 유세포 분석기는 일반적으로 실험 장치였지만, 기술 발전으로 인해 임상 및 연구 목적 모두에서 광범위한 응용이 가능해졌다. 이러한 개발로 인해, 형광 표지된 항체와 같이 수집에 사용되는 시약뿐만 아니라 계측기, 분석 소프트웨어에 대한 상당한 시장이 형성되었다.

임피던스 기반의 단일 세포 분석 시스템은 일반적으로 콜터 계수기로 알려져 있다. 이는 거의 모든 종류의 세포와 입자를 계수하고 크기를 측정하는 잘 확립된 방법이다.

최근에는 복수의 광선과 검출기를 장착한 장치가 시판되고 있으며(광선 4종, 검출기 14종 등), 복수의 항체를 사용함으로써 보다 동시에 고도화된 분석을 할 수 있게 되었다. 또한 셀 소터를 표준 장착한 장치도 있으며, 시스의 유로를 전환함으로써 고정밀도이면서 고속으로 목표 입자를 분취할 수 있다. 시판되는 장치에서는 최대 4종류의 집단으로 분출할 수 있으며, 이론적으로는 1초당 90,000개의 입자를 처리할 수 있다.

3. 1. 유체 시스템

세포는 유세포 분석기에서 세포의 광학적 특성을 정확하게 측정하기 위해 초점이 맞춰진 레이저 빔의 중심을 균일하게 통과해야 한다.[13][14][15] 유체 시스템의 목적은 세포를 하나씩 레이저 빔을 통과시키고 장치 전체로 이동시키는 것이다. 세포 분리 기능이 있는 유세포 분석기의 유체 시스템은 또한 분리된 세포를 수집 튜브 또는 웰로 운반한다.[13]

유체역학적 초점(Hydrodynamic focusing)은 유세포 분석기에서 세포의 정확한 위치를 지정하기 위해 대부분의 세포 계측기에서 사용되는 방식이다.[13][14] 현탁액 속의 세포는 덮개 유체(Sheath fluid)에 의해 둘러싸인 상태로 기기 안으로 들어간다. 샘플 코어는 덮개 유체의 중앙에 유지되며, 샘플 유입 속도, 즉 세포가 레이저 조사 지점을 통과하는 속도는 샘플 코어에 가해지는 덮개 유체의 압력에 의해 제어될 수 있다. 최적의 조건에서 중앙 유체 흐름과 덮개 유체는 섞이지 않는다.

일부 유세포 분석기에서는 음향 집속 기술이 유체역학적 초점을 지원하는 데 사용된다.[13][15] 음향파(>2 MHz)는 시료를 보호액에 넣기 전에 미리 초점을 맞춘다. 미리 초점이 맞춰진 시료는 유체역학적 코어에 주입되어 기기를 통과하며, 이는 높은 시료 투입률에서 데이터 정확도를 높이는 데 도움이 될 수 있다.

3. 2. 광학 시스템

현대식 흐름 세포 계측기는 광학 시스템을 사용하여 빛 신호를 생성한다. 여기에는 램프(수은, 제논)와 고출력 수냉식 레이저(아르곤, 크립톤, 염료 레이저), 저출력 공랭식 레이저(아르곤(488 nm), 적색-HeNe(633 nm), 녹색-HeNe, HeCd(UV)), 다이오드 레이저(파란색, 녹색, 빨간색, 보라색) 등이 포함된다.[11][12]

유세포 분석에서는 일정 파장의 광선(주로 레이저)을 유체에 쬐어 전방 산란(FSC)과 측면 산란(SSC)을 검출한다. 전방 산란광(FSC)은 광선에서 약간 벗어난 방향에서, 측면 산란광(SSC)은 광선과 직각 방향에서 검출하는데, 이는 광선과 같은 축에서는 광원의 강한 빛 때문에 검출기가 포화되기 때문이다. 또한 미세 입자를 형광 물질로 표지하여 레이저 광선에 의해 생긴 형광을 검출하는 형광 검출기가 하나 이상 갖춰진 장치가 많다.

FSC는 세포의 크기에 대한 정보를 제공하고, SSC는 세포 내부 복잡성(핵의 형태, 세포 내 소기관, 막 구조 등)에 대한 정보를 제공한다.

분광 유세포 분석은 프리즘 또는 회절 격자를 사용하여 마커에서 방출된 빛을 검출기 배열 전체에 분산시켜 각 입자의 전체 스펙트럼을 측정한다.[13][16]

3. 2. 1. 광학 필터 종류

형광 물질에서 방출되는 빛은 다양한 파장의 스펙트럼을 가지므로 여러 형광 물질을 조합하면 중첩이 발생할 수 있다. 특이성을 더하기 위해, 광학 필터와 이색성 거울이 빛을 광전자 증배관(PMT) 또는 애벌런치 광다이오드(APD)와 같은 검출기로 필터링하고 이동시키는 데 사용된다.[13] 광학 필터는 대역 통과(BP), 장파 통과(LP), 또는 단파 통과(SP) 필터로 설계된다. 대부분의 유세포 분석기는 이색성 거울과 대역 통과 필터를 사용하여 광학 스펙트럼의 특정 대역을 선택한다.

광학 필터에는 그 특성에 따라 밴드패스 필터(BPF), 로우패스 필터(LPF), 하이패스 필터(SPF)가 있는데, 대부분의 유세포 분석기는 다이크로익 미러와 밴드패스 필터를 채용하여 광학 스펙트럼의 특정 밴드를 선정하고 있다.[71]

3. 3. 신호 처리 시스템

신호 처리 시스템은 검출기에서 수집된 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환하고, 데이터를 분석하는 역할을 한다. 증폭 시스템은 미약한 신호를 증폭하여 분석 가능한 수준으로 만든다. 아날로그-디지털 변환기(ADC)는 전방 산란광(FSC), 측면 산란광(SSC), 염료 특이적 형광 신호 등의 아날로그 측정을 컴퓨터가 처리할 수 있는 디지털 신호로 변환한다.[11] 증폭 시스템은 선형 또는 로그일 수 있다.

현대식 유세포 분석 장비는 일반적으로 여러 개의 레이저와 형광 검출기를 가지고 있으며, 상용 장비의 현재 기록은 레이저 10개[11]와 형광 검출기 30개이다.[12]

4. 데이터 분석

유세포 분석기는 데이터를 히스토그램 (1차원)이나 점 도표 (2차원 또는 3차원) 형태로 나타낸다. 이 영역들은 형광물질에 기초하여 연속적으로 분리될 수 있으며, 이를 "게이팅"이라고 한다.

유세포 분석에 의한 광합성 피코플랑크톤의 해양 시료 분석. ''프로클로로코쿠스'', ''시네코코쿠스'', 피코진핵생물의 세 가지 다른 개체군을 보여준다.


현대식 흐름 세포 계측기는 초당 수천 개의 입자를 "실시간"으로 분석할 수 있으며, 세포 분류기가 있는 경우 지정된 광학적 특성을 가진 입자를 비슷한 속도로 분리하고 격리할 수 있다.

유세포 분석은 미세 입자를 선택적으로 회수하는 기술이다. 유세포 분석에 사용되는 장치를 '''유세포 분석기'''라고 하며, 분취 기능이 있는 장치를 소터, 분취 기능이 없는 장치를 분석기라고 한다. 주로 세포를 개별적으로 관찰할 때 사용된다.

일정 파장의 광선 (주로 레이저)을 유체에 쬐면, 광선에서 약간 벗어난 방향(전방 산란, FSC)과 직각 방향(측면 산란, SSC)의 빛을 검출할 수 있다. 또한, 미세 입자를 형광 물질로 표지하여 레이저 광선에 의해 생긴 형광을 검출하는 형광 검출기를 하나 이상 갖춘 장치가 많다. 이러한 검출기로 유체 속 입자가 빛과 형광에 미치는 영향을 분석하여 입자의 물리·화학적 성질을 추정할 수 있다. 세포의 경우, FSC로부터는 세포의 크기를, SSC로부터는 세포 내부의 복잡성을 분석할 수 있다.

4. 1. 게이팅 (Gating)

유세포 분석기로 생성된 데이터는 1차원 히스토그램이나, 2차원 또는 3차원 점 도표(plot)로 나타낼 수 있다. 이러한 도표에서 나타나는 영역들은 형광 강도에 따라 순차적으로 하위 집합을 추출할 수 있는데, 이를 "게이트(gate)"라고 한다.[19] 특히 혈액학 분야에서는 진단 및 임상 목적을 위한 특정 게이팅 프로토콜이 존재한다.[19]

정상 분포를 보이는 경우, 혈구의 주요 범주로의 측면 산란과 CD45에 의한 유세포 분석 게이팅


개별 단일 세포는 좁게 초점을 맞춘 레이저 빔을 통과하는 "비행 시간"(또는 "펄스 폭"이라고도 함)에 의해 세포 이중체 또는 더 높은 응집체와 구별되는 경우가 많다.[19]

플롯은 종종 로그 스케일로 만들어진다. 서로 다른 형광 염료의 방출 스펙트럼이 겹치기 때문에,[20][21] 감지기에서 발생하는 신호는 전자적 보상뿐만 아니라 계산적으로도 보상해야 한다.

급성 백혈병, 다발성 골수종, 악성 림프종 진단에는 혈구 세포의 표면 마커 분석이 필수적이며, 유세포 분석이 사용된다. 급성 백혈병이나 골수종의 대부분은 종양 세포가 절반 이상을 차지하는 경우가 많으므로, 항원 발현 상태를 파악하기 쉽다. 그러나 악성 림프종의 경우에는 반응성 림프구가 섞여 있으므로, 차트를 읽고 비정상 세포 집단(ACP, abnormal cell population)을 찾아내는 과정이 필요하다. 다음은 ACP를 찾아내는 단서를 정리한 것이다.

면역표현형(Immunophenotype)설명
immunophenotype-1면역글로불린 경쇄 발현에 따른 편향, 즉 경쇄 제한(LCR, light chain restriction) 유무를 조사한다. 정상 반응의 경우에는 κ쇄와 λ쇄 각각 양성인 세포가 섞여 있지만, 대부분의 악성 림프종에서는 둘 중 하나로 편향되는 경우가 많다. LCR 기준은 κ쇄가 λ쇄의 3배 이상이거나, λ쇄가 κ쇄의 2배 이상인 경우이다.
immunophenotype-2범T세포 항원(CD2, CD3, CD5, CD7, TCRαβ쇄)이나 범B세포 항원(CD19, CD20, CD22, CD79a) 중 하나 이상의 항원이 발현되지 않거나, 다른 계열의 항원이 나타날 때 ACP 가능성이 있다.
immunophenotype-3말초 림프 조직에는 존재하지 않거나 극히 적은 세포(CD1a 양성 T세포, CD4+CD8+ 세포, γδT 림프구, NK 세포, 과립구, 단구 등)가 검체 전체의 10%를 초과하는 경우 ACP일 가능성이 높다.



대표적인 스크리닝 검사에 사용되는 유세포 분석 차트는 다음과 같다.

차트설명
λ쇄와 κ쇄둘 다 양성인 세포가 있거나, LCR이 있는 경우 B세포성 림프종의 가능성이 있다.
CD45와 CD22CD45는 백혈구 공통 항원이며, 게이팅에도 사용되는 항원이다. 림프구의 반응성 증가의 경우 CD45, CD22는 모두 양성이 된다. 대형 세포 집단에서 CD45 음성 세포가 우세하다면 비백혈구 계열 병변도 고려해야 한다.
CD19와 CD13B세포성 림프종(특히 림프아세포)이나 과립구 육종에서는 CD19와 CD13이 모두 양성이 되는 경우가 있다. CD19 유무에 관계없이, CD13 양성인 경우에는 CD33, CD34, MPO와 같은 골수구 계열 마커를 추가해야 한다.
CD20와 CD5둘 다 양성인 것은 CLL이나 B세포성 또는 T세포성 악성 림프종의 일부이다.
CD10와 CD2CD10 양성 T세포는 T세포성 종양의 경우에 나타나는 패턴이다. B세포성 종양에서도 CD2, CD10 양성이 되는 경우도 있지만, 다른 ACP에서 이미 확인되었을 것이다.
CD7와 TCRαβ반응성인 경우에는 둘 다 양성이 된다. 편향이 있는 경우에는 ACP일 가능성이 있다.
CD56과 CD3NK 세포 종양의 경우 둘 다 양성이 되는 경우가 많다. NK 세포는 대형 세포이므로 게이팅으로 대형 세포를 노리고 있는지 확인할 필요가 있다.
CD4와 CD8편향만으로는 종양성 여부 판정은 불가능하다. 둘 다 양성, 둘 다 음성인 경우에는 종양 가능성이 있다. T-LBL 또는 ATLL이 가능성으로 생각된다. 그 경우 CD1a, CD34, TdT, HLA-DR, CD25도 정밀 검사한다. CD8에 편향되어 있는 경우에는 EB 바이러스에 의한 반응성 또는 호지킨 림프종 가능성이 있다.
TCRγδ와 CD30둘 다 양성인 경우에는 미분화 대세포 림프종, γδ 세포성 림프종 가능성이 있다. 호지킨 림프종에서는 CD30 양성 세포를 관찰하기도 한다.


4. 2. 보상 (Compensation)

형광 물질은 각자 넓은 형광 스펙트럼을 가진다. 둘 이상의 형광 물질을 사용할 때, 형광 물질 간 스펙트럼 중첩이 발생할 수 있다. 이 현상은 보정이 필요하다.[18] 예를 들어, FITC와 PE의 방출 스펙트럼은 형광 물질에서 방출된 빛이 PE에 사용된 필터를 통과할 때 동일한 파장과 겹칠 수 있다. 이러한 스펙트럼 중첩은 PE 신호에서 FITC 신호의 일부를 제거하거나, 그 반대로 제거하여 보정한다. 이 과정을 색상 보상이라고 하며, 형광 물질을 자체 측정 백분율로 계산한다.[18]

보상은 다변수 유세포 분석 데이터의 스펙트럼 중첩을 보정하는 수학적 과정이다. 형광 물질은 광범위한 스펙트럼을 가질 수 있어 중첩되면 데이터 분석 시 혼란을 야기하는 바람직하지 않은 결과가 초래될 수 있다. 스필오버라고 알려진 이 중첩은 스필오버 계수로 정량화되며, 이는 일반적으로 특정 형광 물질에 대한 검출기가 다른 형광 물질의 파장에서 상당한 피크를 측정함으로써 발생한다. 이러한 보정에는 선형 대수가 주로 사용된다.[18]

일반적으로 하나 이상의 매개변수 그래프가 표시될 때, 다른 매개변수가 표시된 분포에 영향을 주지 않는다는 것을 보여주기 위한 목적이다. 특히 두 개 이상의 매개변수를 사용할 때 이 문제가 더 심각하다. 현재 다차원 매개변수를 효과적으로 표시할 수 있는 도구는 없다. 보상은 세포 간의 구분을 확인하는 데 매우 중요하다.

형광 마이너스 원(FMO) 대조군은 다중 색상 패널을 구축할 때 데이터 해석에 중요하며, 이는 세포가 여러 형광 물질로 동시에 염색되는 경우에 해당한다. FMO 대조군은 주어진 채널에서 형광의 스필오버를 측정하고 보정할 수 있게 한다. FMO 대조군을 생성하려면 검사하려는 형광 물질을 제외한 모든 형광 물질로 표본을 염색한다. 예를 들어, 4가지 다른 형광 물질(A, B, C, D)을 사용하는 경우, FMO 대조군에는 그 중 3개(ABC_, AB_D, A_CD, _BCD)만 포함되어야 한다.

4. 3. 전산 분석 (Computational Analysis)

최근 컴퓨터를 이용한 자동 세포 집단 식별 기술의 발전은 전통적인 게이팅(gating) 방식의 대안을 제시한다. 자동 식별 시스템은 드물거나 숨겨진 세포 집단을 찾는 데 도움을 줄 수 있다. 대표적인 자동화 방법에는 면역학 데이터베이스 및 분석 포털(ImmPort)의 FLOCK[22], SamSPECTRAL[24], Bioconductor의 flowClust[25][26][27], GenePattern의 FLAME[28] 등이 있다. T-분포 확률적 인접 임베딩(t-SNE)은 복잡한 다차원 유세포 분석 데이터를 2차원 "지도"로 시각화하는 차원 축소 알고리즘이다.[29]

FlowCAP (유세포 분석: 세포 집단 식별 방법의 중요 평가)[30]이라는 공개 프로젝트는 여러 데이터 클러스터링 방법을 비교하고 평가하여, 이러한 방법들의 올바른 사용과 적용에 대한 지침을 제공하기 위해 만들어졌다.

5. 형광 활성화 세포 분류 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS)

FACS는 유세포 분석기의 한 종류이다. FACS는 여러 종류의 세포가 섞여 있는 혼합물을 각각의 세포가 가진 빛 산란 및 형광 특성에 따라 분류하는 기술이다. 이는 개별 세포의 형광 신호를 빠르고 객관적이며 정량적으로 기록할 수 있어 유용한 과학적 도구이다. FACS는 BD Biosciences의 등록 상표이다.[31][33] 세포 분류나 분석을 위해 이 기술을 사용하는 대부분의 연구자들은 이 용어를 일반적으로 사용한다. 최초의 세포 분류기는 1965년 Mack Fulwyler에 의해 발명되었으며,[32] 이후 레너드 허젠버그가 이 기술을 확장하여 FACS라는 용어를 만들었다. 허젠버그는 이 획기적인 연구로 2006년 교토상을 수상했다.[34]

Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)


세포 부유액은 좁고 빠르게 흐르는 액체 흐름을 통해 이동한다. 세포들은 직경에 비해 큰 간격을 유지하도록 배열된다. 진동 메커니즘은 세포 흐름을 각각의 물방울에 담기게 한다. 이 시스템은 한 물방울에 두 개 이상의 세포가 들어갈 가능성을 낮추도록 조정된다. 흐름이 물방울로 나뉘기 직전, 각 세포의 형광 특성이 측정되는 형광 측정소를 통과한다. 전기 충전 고리는 흐름이 물방울로 분리되는 지점에 위치한다. 충전된 물방울들은 정전기 편향 시스템을 거쳐 용기로 떨어진다. 전하는 흐름에 직접 가해지며, 분리된 물방울은 흐름과 같은 전하량을 갖는다. 물방울이 분리된 후 흐름은 중성으로 돌아간다.

세포 분류는 특정 물리적 특성의 유무에 따라 세포 집단을 정제하는 방법이다.[13][15][31] 분류 기능을 갖춘 유세포 분석기에서, 기기는 세포 크기, 형태, 단백질 발현 등의 매개변수를 사용하여 세포를 감지하고, 액적 기술을 이용하여 세포를 분류하며, 실험 후 사용을 위해 하위 집합을 회수한다.[13][15]

유세포 분석 세포 분류기는 유세포 분석기와 달리 수집 시스템을 갖추고 있다. 수집 과정은 시료가 흐름 세포와 레이저가 교차하는 보호액 흐름에 주입될 때 시작된다.[35] 이후 흐름은 세포를 진동 노즐로 운반하여 대부분 하나의 세포 또는 세포가 없는 액적을 생성한다. 전기 충전 링은 흐름이 액적으로 분리되는 지점에 배치되며, 형광 강도를 측정하기 직전에 링에 전하가 가해진다. 흐름에서 떨어져 나올 때 액적에 반대 전하가 갇히므로 액적은 전하를 띠게 된다. 대전된 액적은 전하에 따라 액적을 용기로 전환하는 정전기 편향 시스템을 통과한다. 일부 시스템에서는 전하가 흐름에 직접 가해지며, 떨어져 나가는 액적은 흐름과 동일한 부호의 전하를 유지한다. 액적이 떨어져 나간 후 흐름은 중성으로 되돌아간다. 수집된 세포는 추가적인 배양, 조작 및 연구에 사용될 수 있다.

6. 표지 (Label)

유세포 분석에는 세포의 특정 성분을 표시하기 위해 다양한 형광 물질, 양자점, 동위원소 등이 사용된다.

면역표현형 분석은 표지된 항체[36] 및 염료, 염색약과 같은 기타 형광 물질 함유 시약을 사용하여 이질적인 세포 집단을 분석하는 방법이다. 유세포 분석은 형광을 정량적 도구로 사용하며, 그 감도는 공초점 현미경과 같은 다른 형광 검출 플랫폼과 비교할 수 있다. 절대 형광 감도는 공초점 현미경에서 일반적으로 더 낮은데, 이는 초점이 맞지 않는 신호가 공초점 광학 시스템에 의해 거부되고 이미지가 세포 전체의 모든 위치에서 개별 측정을 통해 순차적으로 구성되므로 신호를 수집하는 데 사용할 수 있는 시간이 줄어들기 때문이다.[38]

6. 1. 형광 표지 (Fluorescent Labeling)

유세포 분석에서 형광 물질은 표지(label)로 사용될 수 있다.[20] 형광 물질은 일반적으로 세포 표면이나 내부에 있는 특정 대상을 인식하는 항체에 부착된다. 세포막이나 다른 세포 구조와 결합하는 화학 물질에 부착될 수도 있다. 각 형광 물질은 고유한 여기 및 방출 파장을 가지며, 방출 스펙트럼은 종종 겹친다. 결과적으로 사용할 수 있는 표지 조합은 형광 염료를 여기시키는 데 사용되는 램프나 레이저의 파장과 사용 가능한 검출기에 따라 달라진다.[37] 다양한 파장의 형광 물질을 조합하면 여러 종류의 세포 성분을 동시에 분석할 수 있다.

6. 2. 양자점 (Quantum Dot)

양자점은 좁은 방출 최고점 때문에 기존의 형광 물질 대신 사용되기도 한다.[1]

6. 3. 동위원소 표지 (Isotope Labeling)

란타넘 동위원소를 항체에 부착하여 형광 표지의 한계를 극복하는 방법이다. 이 방법을 사용하면 이론적으로 40개에서 60개의 구별 가능한 표지를 사용할 수 있으며, 30개의 표지에 대해 시연되었다.[39] 세포는 플라즈마에 주입되어 이온화되고, 관련된 동위원소는 비행 시간 질량 분석법을 통해 정량화된다. 이 방법은 많은 수의 표지를 사용할 수 있지만, 현재 유세포 분석법보다 처리량이 낮다. 또한 분석된 세포를 파괴하여 분류에 의한 회수가 불가능하다.[39]

7. 측정 가능 요소

유세포 분석에서 측정 가능한 요소는 다음과 같다.


  • 백혈병 진단[43]
  • 세포의 조직 형태와 부피[43]
  • 엽록소 같은 세포 안료[43]
  • DNA 총 내용 (세포 주기 분석, 세포 운동 에너지, 세포 증식, 염색체의 배수성)[43]
  • RNA 총 내용[43]
  • DNA의 복제수 변이[43]
  • 염색체 분석 및 정렬[43]
  • 단백질 발현[43]
  • 단백질 변경, 인산화 단백질[43]
  • 체내에서 진행되는 유전자 변형 제품[43]
  • 항원의 표면[43]
  • 세포내 항원[43]
  • 항원의 핵[43]
  • 효소 활동[43]
  • pH[43]
  • 막 유동성[43]
  • 세포 사멸[43]
  • 세포 생존력[43]
  • 암세포의 다중약물내성[43]
  • 글루타티온[43]
  • 세포 부착[43]
  • 빛 산란: 정방향 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 측정은 유세포 분석에서 각각 세포 부피 및 형태학적 복잡성을 평가하는 데 사용된다. 이러한 메트릭은 세포의 크기, 과립도 및 모양을 설명한다.[43]
  • 형질전환 제품: 유세포 분석은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 유사 변이체와 같은 형광 단백질을 포함하여 생체 내 형질전환 제품을 평가하는 데 유용하다. 이를 통해 과학자들은 유전자 발현, 단백질 국소화 및 세포 역학을 조사할 수 있다.[43]
  • 다양한 조합: 유세포 분석을 통해 DNA/표면 항원과 같은 많은 측정 가능한 데이터를 통합하여 생물학적 특징과 기능에 대한 포괄적인 이해를 얻을 수 있다.[43]
  • 순환 종양 세포: 유세포 분석은 혈액 샘플에서 순환 종양 세포(CTC)를 분리하고 정제하는 데 필수적이다. CTC는 특정 마커 또는 특징을 타겟팅하여 발견하고 검사할 수 있으며, 암 진단, 예후 및 치료 모니터링을 지원한다.[42]
  • 세포 내 매개변수 모니터링: 유세포 분석은 pH, 세포 내 이온화 칼슘 및 마그네슘 수준, 막 전위, 글루타티온 수준 및 산화성 폭발을 포함한 세포 내 요인을 측정할 수 있다. 이 데이터는 세포 대사, 신호 전달 및 산화 스트레스에 대한 정보를 제공한다.[43]


위의 측정 가능 요소들은 다음 표와 같이 정리할 수 있다.

측정 가능 요소설명
백혈병 진단
세포의 조직 형태와 부피
엽록소 같은 세포 안료
DNA 총 내용세포 주기 분석, 세포 운동 에너지, 세포 증식, 염색체의 배수성
RNA 총 내용
DNA의 복제수 변이
염색체 분석 및 정렬
단백질 발현
단백질 변경인산화 단백질
체내에서 진행되는 유전자 변형 제품
항원의 표면
세포내 항원
항원의 핵
효소 활동
pH
막 유동성
세포 사멸
세포 생존력
암세포의 다중약물내성
글루타티온
세포 부착
빛 산란정방향 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 측정, 세포 부피 및 형태학적 복잡성 평가
형질전환 제품녹색 형광 단백질(GFP) 또는 유사 변이체와 같은 형광 단백질, 유전자 발현, 단백질 국소화 및 세포 역학 조사
다양한 조합DNA/표면 항원과 같은 많은 측정 가능한 데이터를 통합
순환 종양 세포혈액 샘플에서 순환 종양 세포(CTC)를 분리하고 정제, 암 진단, 예후 및 치료 모니터링 지원
세포 내 매개변수 모니터링pH, 세포 내 이온화 칼슘 및 마그네슘 수준, 막 전위, 글루타티온 수준 및 산화성 폭발을 포함한 세포 내 요인 측정


8. 이용 분야

유세포분석기는 단일클론항체 및 형광염색소와 함께 발전했으며, 이를 통해 하나의 세포가 갖는 면역 상태를 파악하고 여러 면역질환 연구에 이용된다. 또한 세포 혹은 핵 내의 DNA 양을 분석해 악성종양의 성격을 파악한 후 진단이나 치료 과정을 설정하고, 경과 상태를 파악하는 데 도움을 준다. 그 밖에도 염색체 연구, 망상적혈구 측정, 세포 내 칼슘 측정, 미생물 검사 등에도 이용되며, 그 적용 범위가 더욱 넓어지고 있다.[44] 분자 생물학, 면역학, 병리학 등 수많은 분야에서 활용되며, 의약품 개발에도 응용된다. 해양 생물학에서는 자발형광 특성을 가진 플랑크톤 분석에 이용된다. 단백질 공학에서는 효소와 박테리아의 결합에 이용된다.

유세포 분석 기술은 분자 생물학, 병리학, 면역학, 바이러스학,[44] 식물 생물학, 해양 생물학 등 다양한 분야에서 응용된다.[45] 특히 이식, 혈액학, 종양 면역학 및 화학 요법, 산전 진단, 유전학, 성 감별을 위한 정자 분류 등 의학 분야에서 광범위하게 응용된다. 남성 불임 검사에서 DNA 단편화와 관련된 정자 세포 이상을 감지하는 데 널리 사용된다.[46][47] 또한, DNA 손상,[48][49] 카스파제 절단 및 세포 자멸사 감지 연구에도 광범위하게 사용된다.[50] 광음향 유세포 분석은 염료로 표지된 박테리오파지로 표지된 혈액 내 박테리아를 감지, 식별 및 정량화하기 위해 다제 내성 박테리아(가장 흔하게 MRSA) 연구에 사용된다.[51] 신경과학 분야에서는 세포 표면 및 세포 내 항원의 공동 발현을 분석할 수 있다.[52] 미생물학에서는 GFP를 암호화하는 전이인자 (TnMHA)를 사용하여 구성된 전이인자 돌연변이 라이브러리를 선별 및 분류하거나,[53] 생존력을 평가하는 데 사용될 수 있다.[54] 단백질 공학 분야에서 유세포 분석은 원하는 특성을 가진 세포 표면 표시 단백질 변이체를 식별하기 위해 효모 디스플레이 및 세균 디스플레이와 함께 사용된다.

조직학 및 IHC에 비해 유세포 분석의 주요 장점은 항원의 양을 정확하게 측정할 수 있고, 각 세포를 여러 항체-형광체로 염색할 수 있다는 점이다. 현재 실험실에서는 각 세포에 약 10개의 항체를 결합할 수 있다. 이는 최대 40개까지 측정할 수 있는 질량 세포 계측기보다는 적지만, 더 높은 가격과 더 느린 속도로 이루어진다.

수생 생태계에서 유세포 분석은 자가 형광 세포 또는 첨가된 염료로 형광 표지된 세포 분석에 사용된다. 이 연구는 1981년 클라리스 옌츠치가 적조를 유발하는 와편모조류의 형광을 측정하기 위해 유세포 분석을 사용하면서 시작되었다.[55] 이듬해 연구자들은 형광 특성에 따라 구별할 수 있는 여러 조류 종의 유세포 분석 측정을 발표했다.[56] 1983년까지 해양 연구자들은 자체 유세포 분석기를 조립하거나[57] 버뮤다 해안에서 채취한 해수 표본에 상업적으로 사용 가능한 유세포 분석기를 사용하여 식물성 플랑크톤 세포를 비생물 재료와 구별하고, 남세균을 혼합 군집에서 분류하여 실험실에서 배양할 수 있음을 입증했다.[58] 유세포 분석을 통해 해양 연구자들은 희미하게 형광을 내는 ''프로클로로코쿠스''와 종속 영양 미생물을 구별할 수 있었는데, 이는 현미경 기반 평가로는 어려운 구별이었다.[59] 기술 발전으로 현재 수생 과학자들은 연구 크루즈 동안 유세포 분석기를 지속적으로 사용할 수 있으며,[60] 유세포 분석기는 개별 식물성 플랑크톤 세포의 이미지를 제공하는 데 사용된다.[61][62] 해양 과학자들은 유세포 분석기의 분류 기능을 사용하여 세포 활동과 다양성을 개별적으로 측정하고,[63][64] 근접하게 서식하는 미생물 간의 상호 공생 관계를 조사하며,[65] 해양에서 여러 과정의 생지화학적 속도를 측정한다.[66]

세포 증식은 면역계의 주요 기능이다. 어떤 결론을 내리기 위해 세포의 증식 특성을 분석해야 하는 경우가 많다. 세포 증식을 결정하는 한 가지 검사법은 추적 염료 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)이다. 이는 증식하는 세포를 모니터링하는 데 도움이 된다. 이 검사법은 시계열 실험에서 정량적 및 정성적 데이터를 제공한다.[67] 이 염료는 세포 내에 존재하는 오래 지속되는 분자와 공유 결합한다. 세포가 분열하면 분자도 분열하며, 딸세포는 모세포 집단보다 염료를 절반만 갖게 된다. 이러한 강도 감소는 유세포 분석으로 시각화할 수 있다.[68] 문헌에 따르면, 유세포 분석과 CFSE의 이 기술은 백혈병과 같은 암에서 표적 세포를 사멸시키는 T 세포의 효율성을 찾는 데 사용되어 왔다. 표적 세포의 신속하고 느린 사멸을 시각화하기 위해 과학자들은 특정 종류의 세포의 항체 염색과 형광 표지된 미세 구슬을 사용하여 CFSE 표지를 사용했다. 이는 또한 특정 사이토카인의 처리에 따른 표적 세포의 증식에 관한 정보를 제공했다.[69]

유세포 분석은 게놈 크기, 더 정확하게는 세포 또는 세포 핵 내 DNA의 양을 측정하는 데 사용되어 왔다. 게놈은 전체 게놈 시퀀싱을 통해 더 정확하게 분석할 수 있지만, 시퀀싱에 의해 놓치기 쉽거나 (또는 염색체에 할당할 수 없어 분석 단계에서 걸러지는) 마이크로염색체 또는 반복 서열의 비율이 높기 때문에 종종 어렵다. 그러나 유세포 분석 역시 완벽하지 않다. 사용된 염료에 따라 얻어지는 게놈 크기가 달라질 수 있다. 물고기 게놈 분석 결과, 요오드화 프로피디움 (PI)과 DAPI를 각각 사용했을 때 게놈 크기가 상당히 다르게 나타났다. 예를 들어, ''일본 뱀장어''(Anguilla japonica)의 게놈은 PI로 1.09pg의 DNA를 포함하는 것으로 나타났고, DAPI로는 1.25pg이었다. 마찬가지로, ''중국 흰지느러미 상어''(Myxocyprinus asiaticus)의 게놈은 2.75pg의 DNA (PI)와 3.08pg (DAPI)를 포함하는 것으로 나타났다. 즉, 차이는 12~14% 정도였다.[70]

유세포 분석은 분자 생물학을 시작으로 병리학, 면역학, 해양 생물학 등에서 사용된다. 또한 분자 생물학적 기법인 형광으로 표지한 항체를 사용하여 표적 세포를 특정하는 방법은 세포 분화 연구뿐만 아니라 의학 분야에서도 활용 가치가 높아 이식, 종양 면역학, 화학 요법, 유전학, 재생 의학 등에서 사용된다.

식물에 적용하는 경우, 표지된 DNA 양을 측정하여 배수성을 특정할 수 있다.

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