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히스택

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목차

1. 개요

히스택(His-tag)은 단백질 정제에 사용되는 펩타이드 태그로, 단백질 표면에 부착되어 금속 이온에 대한 친화도를 높여 정제를 용이하게 한다. 히스티딘 잔기가 금속 이온과 강하게 결합하는 성질을 이용하여, 일반적으로 6개의 히스티딘 잔기(6xHis-tag)로 구성되며, 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 통해 단백질을 분리한다. 히스택은 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 추가될 수 있으며, 벡터 삽입 또는 PCR 방법을 통해 부착할 수 있다. His-tag는 항-His-tag 항체 또는 금속 이온 함유 형광 프로브를 사용하여 검출할 수 있으며, HQ, HN, HAT 태그와 같은 유사한 태그도 존재한다.

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히스택
개요
명칭히스티딘 태그, 히스-태그
다른 명칭His-태그, 헥사히스티딘 태그, 폴리히스티딘 태그
용도단백질 정제, 단백질 검출
상세 정보
구성최소 6개의 히스티딘 (His) 잔기로 구성된 아미노산 서열
서열HHHHHH (일반적), 변형 가능
결합니켈 (Ni2+), 코발트 (Co2+), 아연 (Zn2+), 구리 (Cu2+) 등의 금속 이온
결합 방식이미다졸 고리의 질소 원자를 통해 금속 이온과 배위 결합
활용
단백질 정제친화성 크로마토그래피 (니켈 컬럼 등)
단백질 검출항-His 태그 항체 이용 (웨스턴 블롯, ELISA 등)
장점
사용 편의성다양한 발현 시스템에 적용 가능
높은 효율강한 결합력으로 효과적인 정제 가능
경제성비교적 저렴한 비용으로 활용 가능
단점
단백질 기능 영향His-태그가 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있음
제거 필요성필요에 따라 His-태그 제거 효소 사용
제거 효소
종류엔테로키나아제, 트롬빈 등

2. 원리

단백질은 표면에서 금속 이온을 배위하는 성질을 가지고 있으며, 이러한 금속 이온에 대한 친화도의 차이를 이용하여 크로마토그래피 방식으로 단백질을 분리하는 것이 가능하다. 이것은 1975년에 처음 소개된 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)의 기본 원리이다.[3][24] 후속 연구를 통해 단백질을 구성하는 아미노산 중에서 특히 히스티딘 잔기가 금속 이온과의 배위 결합에 강하게 관여한다는 사실이 밝혀졌다.[4][25]

따라서 유전자 공학 기술을 이용하여 특정 단백질의 말단에 여러 개의 히스티딘 잔기를 인위적으로 추가하면(이를 폴리히스티딘 태그 또는 His-tag라고 한다), 해당 단백질은 금속 이온에 대해 훨씬 강한 친화성을 갖게 된다. His-tag가 부착된 단백질이 포함된 용액을 니켈(Ni2+)과 같은 금속 이온이 고정된 담체(resin)와 접촉시키면, His-tag의 히스티딘 잔기들이 금속 이온을 킬레이트하면서 담체에 선택적으로 강하게 결합한다. 반면, His-tag가 없는 다른 단백질들은 담체에 거의 결합하지 않거나 매우 약하게 결합하므로, 적절한 버퍼로 담체를 세척하여 쉽게 제거할 수 있다. 마지막으로, 담체에 결합된 His-tag 단백질만을 특정 조건(예: 이미다졸 첨가 등)을 이용하여 분리(용리)함으로써 원하는 단백질을 높은 순도로 회수할 수 있다.[5]

2. 1. 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC)

Ni(NTA)(H2O)2의 X선 구조


단백질은 표면에 있는 아미노산 잔기를 통해 금속 이온과 배위 결합을 형성할 수 있다. 이러한 금속 이온에 대한 친화도의 차이를 이용해 크로마토그래피 방식으로 단백질을 분리하는 기술이 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC)이다. 이 기술은 1975년 '금속 킬레이트 친화 크로마토그래피'라는 이름으로 처음 소개되었다.[3][24]

후속 연구를 통해 단백질을 구성하는 아미노산 중 특히 히스티딘(histidine)이 금속 이온과의 배위 결합에 강하게 관여한다는 사실이 밝혀졌다.[4][25] 이 원리를 이용하여, 유전자 공학 기술로 특정 단백질의 말단(N-말단 또는 C-말단)에 여러 개의 히스티딘 잔기(보통 6개, 6xHis-tag)를 인위적으로 추가한 것을 히스택(His-tag)이라고 한다. His-tag가 부착된 단백질은 금속 이온에 대한 친화성이 크게 증가하여, 혼합물 속에서 해당 단백질만을 선택적으로 분리하고 정제하는 데 유용하게 사용된다.

His-tag 단백질 정제 과정은 다음과 같다. 먼저, 니켈(Ni2+)이나 코발트(Co2+)와 같은 금속 이온을 킬레이트하여 고정시킨 담체(resin)를 준비한다. 주로 이미노디아세트산(IDA)이나 니트릴로트리아세트산(NTA) 유도체가 결합된 고체 지지체가 사용된다.[13] His-tag가 부착된 단백질이 포함된 용액을 이 담체와 접촉시키면 (보통 pH 8 이상 조건), 단백질의 히스티딘 잔기들이 담체에 고정된 금속 이온과 강하게 결합한다. 반면, His-tag가 없거나 다른 단백질들은 담체에 결합하지 않거나 매우 약하게 결합한다. 따라서 적절한 버퍼로 담체를 여러 번 세척하면 불순물 단백질들을 효과적으로 제거할 수 있다.

세척 후 담체에 결합된 순수한 His-tag 단백질을 회수하는 과정을 용리(elution)라고 한다. 단백질의 변성을 최소화하기 위해 가능한 온화한 방법을 사용하는 것이 좋으며, 주로 다음 세 가지 방법이 사용된다.[5]

His-tag 단백질 용리 방법
방법원리사용 물질 및 조건
유사체와의 경쟁His-tag와 유사한 구조를 가진 화합물을 고농도로 첨가하여, 담체의 금속 이온에 대한 결합을 경쟁적으로 방해함으로써 His-tag 단백질을 분리시킨다.이미다졸(Imidazole, 히스티딘 측쇄 구조 유사체)을 150 - 500 mM 농도로 사용. 히스티딘 또는 히스타민도 사용 가능.
pH 감소용액의 pH를 낮추면 히스티딘 잔기의 이미다졸 고리가 양성자화되어 (+)전하를 띠게 된다. 이로 인해 금속 이온과의 배위 결합 능력을 상실하여 단백질이 담체로부터 분리된다.사용하는 금속 이온 종류에 따라 최적 pH가 다르다. 니켈(Ni2+) 사용 시 약 pH 4, 코발트(Co2+) 사용 시 약 pH 6에서 용리된다.
금속 이온 제거EDTA와 같이 금속 이온과 매우 강하게 결합하는 킬레이트제를 첨가하여 담체에 고정된 금속 이온 자체를 제거한다. 금속 이온이 제거되면 His-tag 단백질도 함께 분리된다.EDTA 등 강력한 킬레이트제 사용.



이러한 방법들을 통해 담체로부터 분리된 His-tag 단백질을 높은 순도로 회수할 수 있다. 필요에 따라 이 방법들을 조합하여 사용하기도 한다.

2. 2. 실용적인 선택

다양한 담체(carrier matrix)는 고체 수지 지지체에 결합된 형태로 시판되며, 여기에 금속 양이온을 결합시켜 사용한다. 이미노디아세트산(IDA)과 니트릴로트리아세트산(NTA) 유도체가 이러한 목적으로 가장 자주 사용되며, 특히 Ni-NTA (니켈-니트릴로트리아세트산)가 널리 쓰인다. 담체의 종류에 따라 특정 응용 분야에서 장단점이 있을 수 있다.[13] 컬럼에 충전하여 사용하는 방식 외에도, 시험관 내에서 원심 분리나 자기 분리와 함께 사용하는 등 다양한 활용법이 있다.

히스티딘 태그의 작용기인 이미다졸은 여러 전이 금속 양이온과 높은 친화성을 보인다. 주로 2가 양이온 M2+ (M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn 등)을 사용한다. 금속 이온의 선택은 일반적으로 결합 능력과 최종 정제 순도 사이에서 결정된다.

  • 니켈(Ni): 결합력과 순도 사이의 균형이 좋아 가장 일반적으로 사용된다.[13][14]
  • 코발트(Co): 숙주 세포 유래 단백질과의 비특이적 결합이 적어 정제 순도를 높이고자 할 때 사용될 수 있다. 그러나 결합 능력은 니켈보다 낮다.[13][14]
  • 기타: 구리(Cu)는 가장 친화성이 높고, 아연(Zn)도 사용될 수 있다. 금속 이온에 대한 친화성 순서는 일반적으로 Cu > Ni > Zn > Co 이다.


His-tag 단백질을 담체로부터 용리(elution)하기 위해 여러 가지 방법이 있으며, 필요에 따라 조합하여 사용할 수도 있다. 단백질 변성을 피하기 위해 가능한 한 온화한 방법을 사용하는 것이 좋으며, 이런 이유로 이미다졸을 이용한 경쟁적 용리가 자주 사용된다.

  • 유사체와의 경쟁: His-tag와 구조가 유사하며 고정된 금속 이온과 배위 결합을 형성할 수 있는 화합물을 이용한다. 이미다졸은 히스티딘의 측쇄이며, 일반적으로 150 - 500 mM 농도로 용리에 사용된다. 고농도의 이미다졸은 담체에 결합된 His-tag 단백질과 경쟁하여 금속 이온 결합 부위를 차지함으로써 단백질을 용리시킨다. 히스티딘이나 히스타민도 사용될 수 있다.
  • pH 감소: 용액의 pH를 낮추면 히스티딘 잔기의 이미다졸 고리가 양성자화되어 금속 이온과 더 이상 배위 결합을 유지할 수 없게 되어 단백질이 담체에서 분리된다. 니켈 이온을 사용하는 경우 약 pH 4에서, 코발트 이온을 사용하는 경우 약 pH 6에서 용리된다.
  • 금속 이온 제거: EDTA와 같은 강력한 킬레이트제를 첨가하면 담체에 고정된 금속 이온이 킬레이트제와 결합하여 제거되므로, 결과적으로 단백질이 담체에서 분리된다.

3. 응용

폴리히스티딘 태그(His-tag)는 그 특유의 금속 이온 결합 능력 덕분에 생명과학 연구의 다양한 분야에서 폭넓게 응용된다. 가장 대표적인 응용 분야는 재조합 단백질을 손쉽게 분리하고 정제하는 친화성 크로마토그래피 방법으로 널리 사용된다.[26][3] 또한, 단백질 간의 상호작용을 연구하거나(풀다운 분석),[18] 형광 표지를 통해 단백질의 세포 내 위치나 이동을 추적하는 데에도 활용된다.[19] 이 외에도 특정 표면에 단백질을 고정시키는 기술 등 다양한 실험 기법에 응용되고 있다.[1][2]

3. 1. 단백질 정제

폴리히스티딘 태그(His-tag)는 주로 대장균과 같은 원핵생물 발현 시스템에서 생산된 재조합 단백질의 친화성 정제에 널리 사용되는 방법이다.[26] 이 기술은 단백질 끝에 인위적으로 추가된 여러 개의 히스티딘 잔기가 특정 금속 이온과 강하게 결합하는 성질을 이용한다.

정제의 기본 원리는 고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피(IMAC, Immobilized Metal ion Affinity Chromatography)에 기반한다.[3] 단백질을 구성하는 아미노산 중 히스티딘은 니켈(Ni2+)이나 코발트(Co2+) 같은 금속 이온과 배위 결합을 형성하는 능력이 뛰어나다.[4] 따라서 재조합 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 6개 이상의 히스티딘 잔기(His-tag)를 붙이면, 이 단백질은 금속 이온이 킬레이트 형태로 고정된 레진(수지)에 특이적으로 강하게 결합하게 된다.[5] 반면, His-tag가 없는 다른 단백질들은 레진에 결합하지 않거나 약하게 결합하므로 쉽게 제거할 수 있다.
정제 과정은 일반적으로 다음과 같은 단계로 진행된다.[13][14][15]

# 세포 용해: His-tag 단백질을 발현시킨 세포(대장균 등)를 원심 분리하여 수확한 뒤, 물리적 방법(예: 초음파 처리, 균질기 사용)이나 화학적 방법(세제, 리소자임 효소 처리 등) 또는 이들의 조합을 이용하여 세포를 파쇄하고 내용물을 용출시킨다. 이 용해물에는 목적하는 His-tag 단백질 외에도 숙주 세포에서 유래한 수많은 다른 단백질과 세포 구성 성분들이 섞여 있다.

# 레진 결합: 세포 용해물을 금속 이온(주로 니켈 또는 코발트)이 고정된 친화성 레진과 혼합한다. 레진은 주로 세파로스나 아가로스 기반의 담체에 NTA(니트릴로트리아세트산)나 IDA(이미노다이아세트산) 같은 킬레이트제가 결합된 형태이다. His-tag 단백질은 레진의 금속 이온과 특이적으로 결합한다. 이 과정은 레진을 용해물에 직접 넣어 섞는 배치(batch) 방식이나, 레진을 채운 크로마토그래피 컬럼에 용해물을 통과시키는 방식으로 수행될 수 있다. 니켈과 코발트는 주기율표에서 인접한 전이 금속으로 비슷한 성질을 가지지만, 일반적으로 니켈 기반 레진이 결합 용량은 더 높고, 코발트 기반 레진은 더 높은 순도를 제공하는 경향이 있다.

# 세척: 레진에 결합하지 않은 불순물 단백질이나 약하게 비특이적으로 결합한 단백질들을 제거하기 위해 적절한 조성의 세척 완충액(wash buffer)으로 레진을 여러 번 씻어낸다. 니켈 기반 레진을 사용할 경우, 세척 완충액에 낮은 농도(약 20mM)의 이미다졸을 첨가하면 비특이적 결합을 줄여 정제 효율을 높일 수 있다.

# 용출: 레진에 강하게 결합된 His-tag 단백질을 분리하여 회수하는 단계이다. 주로 두 가지 방법이 사용된다.

#* 이미다졸 경쟁: 이미다졸은 히스티딘의 곁사슬과 구조가 유사하여 금속 이온에 결합할 수 있다. 높은 농도(보통 150-300 mM)의 이미다졸을 포함한 용출 완충액(elution buffer)을 흘려주면, 이미다졸이 His-tag 대신 금속 이온에 결합하면서 His-tag 단백질이 레진에서 떨어져 나오게 된다.

#* pH 변화: 완충액의 pH를 낮추면(니켈의 경우 pH 4, 코발트의 경우 pH 6 정도) 히스티딘 잔기가 양성자화(protonation)되어 금속 이온과의 결합력이 약해지면서 단백질이 용출된다.

정제된 단백질의 순도와 양(수율)은 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 분석이나 웨스턴 블롯을 통해 평가한다.[13][14][15]

His-tag 정제법의 중요한 장점 중 하나는 단백질의 3차 구조(접힘 상태)에 크게 의존하지 않는다는 점이다. 즉, 단백질의 아미노산 서열(1차 구조)에 있는 His-tag만으로 결합이 이루어지기 때문에, 요소나 염산 구아니딘과 같은 변성제에 의해 단백질 구조가 풀어진 상태(변성)에서도 정제가 가능하다. 이는 재조합 단백질이 세포 내에서 불용성의 봉입체(inclusion body) 형태로 생성되었을 경우 특히 유용하다. 반면, 항체 기반 정제나 GST 태그 정제 등 다른 많은 친화성 정제법들은 단백질이 올바른 3차 구조를 유지해야만 효율적으로 작동한다.

3. 1. 1. 한계 및 개선

폴리히스티딘 태그를 이용한 친화성 정제는 재조합 단백질이 원핵생물(특히 ''대장균'')에서 발현될 때 비교적 순수한 단백질을 얻는 효과적인 방법이지만, 몇 가지 한계점과 개선 방안이 존재한다.[13][14][15]

정제 과정에서 목적 단백질 외에 일부 숙주 세포 유래 단백질이 불순물로 함께 정제될 수 있다.[16][14][13][17] 대표적인 예로 ''대장균''의 FKBP 형태 펩티딜 프로릴 이성질체화효소인 SlyD가 있으며, 이는 SDS-PAGE 상에서 약 25kDa ~ 27kDa 크기에서 나타난다.[27] 이러한 불순물은 정제된 단백질의 순도를 낮출 수 있다.

이러한 불순물 문제를 해결하고 단백질 순도를 높이기 위해 다음과 같은 방법들이 사용된다.

  • 이차 정제 단계 추가: 1차 친화성 정제 후, 이온 교환 크로마토그래피나 크기 배제 크로마토그래피와 같은 추가적인 크로마토그래피 단계를 거쳐 불순물을 제거할 수 있다.[16]
  • SlyD 결손 균주 사용: SlyD와 같은 특정 불순물이 주요 문제일 경우, 해당 단백질(예: ''slyD'' 유전자)이 결손된 대장균 균주를 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다.[27]
  • 코발트 기반 레진 사용: 일반적으로 사용되는 니켈 기반 레진 대신 코발트 기반 레진을 사용하면 단백질 순도를 높일 수 있다. 코발트 기반 레진은 내인성 단백질과의 비특이적 결합이 니켈 기반 레진보다 적고, 특히 ''대장균'' 유래 SlyD와는 결합하지 않는 장점이 있다.[13][14][28][16] 다만, 니켈 레진에 비해 단백질 결합 용량은 다소 낮을 수 있다.[13][14]
  • 이미다졸 농도 조절: 세척 단계에서 완충액에 낮은 농도(약 20mM ~ 40mM)의 이미다졸을 첨가하면, 약하게 결합된 불순 단백질을 효과적으로 제거하여 순도를 개선할 수 있다.[16][27]


한편, 효모와 같은 진핵생물에서 단백질을 발현시키는 경우, 원핵생물보다 더 많은 종류의 불순 단백질이 존재할 수 있어 더 높은 순도의 정제가 필요할 수 있다.[29] 이런 경우에는 폴리히스티딘 태그 외에 다른 종류의 친화성 태그를 함께 사용하는 탠덤 친화성 정제(tandem affinity purification) 방법을 사용하기도 한다.[29] 하지만 코발트 기반 레진을 사용하면 순도가 상당히 개선되어 단일 단계 정제만으로도 충분한 순도를 얻는 경우가 있다.[29]

3. 2. 결합 분석

His-tag는 풀다운 분석(pull-down assay)과 유사한 방식으로 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이는 GST 태그 등 풀다운 분석에 일반적으로 사용되는 다른 태그와 비교했을 때 몇 가지 장점을 가진다. His-tag는 크기가 작고, 운반체 매트릭스에 자연적으로 결합하는 단백질 수가 적으며, 단클론 항체 매트릭스에 비해 운반체 매트릭스의 안정성이 높다는 장점이 있다.[18]

하지만 His-tag를 이용한 분석은 민감도가 상대적으로 낮은 것으로 여겨지며, 실험 조건에도 제한이 따른다. 예를 들어, 환원 조건에서는 사용할 수 없으며, EDTA나 특정 종류의 계면활성제(세제) 사용이 제한된다.

또한, 마이크로타이터 플레이트나 단백질 어레이용 유리 슬라이드 표면을 금속 이온으로 코팅하여 His-tag가 부착된 단백질을 고정시키는 데 활용할 수도 있다.

3. 3. 형광 태그

헥사히스티딘 CyDye 태그는 형광 물질에 니켈이 EDTA 그룹과 공유 결합하여 폴리히스티딘 태그에 부착되는 염료를 생성하는 방식으로 개발되었다. 이 기술은 단백질의 이동 및 수송을 추적하는 데 유용하며, Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 거리를 측정하는 데 효과적일 수 있음이 밝혀졌다.[19]

3. 4. 기타 응용

His-tag는 특정 표면에 단백질을 고정시키는 데 사용될 수 있다.[1] 이러한 표면에는 니켈이나 코발트 같은 금속 이온으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트나 단백질 어레이용 유리 슬라이드 등이 있으며, 여기에 His-tag가 부착된 단백질이 고정된다.[1][2]

또한, GST 태그와 마찬가지로 풀다운 분석에도 His-tag를 사용할 수 있다. 그러나 His-tag는 GST 태그에 비해 감도가 낮다는 단점이 있으며, 환원 조건이나 EDTA, 다수의 계면활성제를 사용할 수 없는 등 실험 조건에 제약이 따른다.[1]

4. His-tag 추가 방법

히스티딘 태그(His-tag) 추가 방법 예시. (A) 벡터 삽입 방식 (B) PCR 방식


폴리히스티딘 태그(Polyhistidine-tag), 흔히 히스택(His-tag)은 단백질 정제 및 검출에 널리 사용되는 단백질 태그이다. 가장 일반적인 형태는 6개의 히스티딘 잔기가 연속적으로 이어진 6xHis 태그이다.[6][7][8]

이 태그는 일반적으로 대상 단백질의 코딩 서열 앞쪽(N-말단)이나 뒤쪽(C-말단)에 융합시킨다.[14][9] 어느 말단에 태그를 부착할지는 주로 단백질의 구조 및 기능적 특성, 그리고 정제 후 태그를 제거할 필요성 및 방법에 따라 결정된다. 예를 들어, 단백질의 특정 말단이 기능에 중요하거나 단백질 내부에 묻혀 있는 경우, 다른 쪽 말단을 선택해야 할 수 있다. 또한, 엑소펩티다아제를 이용한 태그 제거는 주로 N-말단에서만 용이하므로, C-말단 태그 제거는 다른 방법을 고려해야 한다.

His-tag를 단백질 유전자에 추가하는 주된 방법에는 두 가지가 있다.

# '''벡터 삽입''': His-tag 서열이 미리 포함된 발현 벡터에 목적 단백질의 유전자를 삽입하는 방법이다.

# '''PCR 방법''': His-tag 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 목적 유전자에 직접 태그 서열을 추가하는 방법이다.

각 방법에 대한 자세한 내용은 아래 하위 섹션에서 설명한다.

4. 1. 벡터 삽입



히스택(His-tag)은 일반적으로 6개의 히스티딘 잔기로 구성된다.[6][7][8] 이 태그를 단백질에 부착하는 가장 기본적인 방법 중 하나는, 관심 있는 단백질의 유전자를 다중 히스티딘 태그 서열이 이미 포함된 벡터에 서브클로닝하는 것이다.[9]

이러한 방식은 단백질을 암호화하는 DNA를 히스택이 포함된 벡터 안에 넣는 것으로, 비교적 간단하게 히스택을 원하는 단백질의 말단에 자동으로 붙일 수 있다. 시중에는 다양한 발현 시스템에서 사용할 수 있도록 여러 종류의 벡터가 개발되어 있다. 이 벡터들은 다중 히스티딘 태그가 N말단이나 C말단 등 다양한 위치에 미리 설계되어 있으며, 특정 프로테아제에 의해 잘리는 절단 부위나 다른 종류의 단백질 태그가 함께 포함된 경우도 많다.[9]

어느 말단(N말단 또는 C말단)에 태그를 붙일지는 주로 단백질 자체의 특성이나, 추후 정제된 단백질에서 태그를 제거할 필요성 및 방법에 따라 결정된다. 예를 들어, 단백질의 특정 말단 부위가 단백질의 핵심 구조 형성에 관여하거나 기능 수행에 중요하다면, 해당 말단을 피해서 다른 쪽 말단에 태그를 붙여야 한다. 또한, 정제 후 태그를 제거해야 할 경우, 흔히 사용되는 엑소펩티다아제는 주로 N말단에 붙은 His 태그만 제거할 수 있다는 점을 고려해야 한다. C말단에 붙은 태그를 제거하려면 다른 기술이 필요할 수 있다.

4. 2. PCR 방법



PCR을 이용하여 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 부착하는 방법도 널리 사용된다.[14][10] 이 기술은 특정 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 관심 단백질을 암호화하는 DNA에 직접 His-tag 서열을 추가하는 방식이다.

프라이머는 히스티딘을 암호화하는 코돈(CAT 또는 CAC)이 여러 개 반복되는 서열을 포함하도록 설계된다. 이 반복 서열은 일반적으로 단백질의 N말단에 해당하는 시작 코돈 바로 다음이나, C말단에 해당하는 종결 코돈 바로 앞에 위치하게 된다. 프라이머는 또한 His-tag 서열 외에도, 증폭하고자 하는 단백질 유전자의 특정 부위에 결합할 수 있도록 최소 16개 이상의 상보적인 염기 서열을 가져야 한다.

PCR을 이용해 6xHis-tag를 추가하기 위해 디자인된 프라이머의 예. 6개의 히스티딘을 코딩하는 18개의 염기가 시작 코돈 바로 다음 또는 정지 코돈 바로 앞에 삽입된다. 관심 유전자 서열과 상보적인 최소 16개의 염기가 His-tag 서열 옆에 필요하다.


가장 흔하게 사용되는 6xHis-tag의 경우, 6개의 히스티딘 잔기를 암호화하기 위해 총 18개 염기(예: CATCATCATCATCATCAT 또는 CACCACCACCACCACCAC)가 프라이머에 포함된다. PCR 반응을 통해 이 프라이머 서열이 증폭되면서 단백질 유전자의 원하는 말단에 6xHis-tag가 삽입된다. 6xHis-tag가 추가되면 단백질의 분자량은 약 1kDa 증가한다.

때로는 His-tag와 목적 단백질 사이에 유연한 링커(linker) 서열(예: 글리신-글리신-글리신 또는 글리신-세린-글리신)을 삽입하기도 한다. 이는 His-tag가 단백질의 구조나 기능에 영향을 미치는 것을 방지하기 위함이다.

5. 검출

폴리히스티딘 태그(His-tag)는 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 검출 방법으로는 항-폴리히스티딘-택 항체를 이용하거나, 금속 이온을 함유한 형광 프로브를 이용한 겔 염색(SDS-PAGE, 네이티브 PAGE)이 가능하다.[21] 이러한 방법들은 세포 내 위치 측정, ELISA, 웨스턴 블롯 및 기타 면역학적 분석 방법들에서 유용하게 활용될 수 있다.[21]

특수한 예로, 헥사히스티딘 CyDye 태그가 개발되었다. 이 태그는 니켈 공유 결합을 통해 형광 물질에 부착된 EDTA 그룹에 결합하여 폴리히스티딘 태그에 부착되는 염료이다. 이 기술은 단백질의 이동 및 수송을 추적하는 데 유용하며, Förster 공명 에너지 전달(FRET) 기법을 통해 분자 간의 거리를 측정하는 데 효과적일 수 있음이 밝혀졌다.[19]

His 태그를 단백질에 부착하면 단백질의 분자량이 약 1 kDa 정도 증가한다. 그러나 SDS-PAGE에서 단백질의 이동 속도는 이론적인 예상보다 느려지는 경향이 있으며, 이로 인해 겉보기 분자량이 실제보다 수 kDa 이상 더 크게 나타나는 경우도 있다.

6. 유사 태그

HQ 태그, HN 태그, HAT 태그 등이 히스택의 유사 태그로 사용된다.

6. 1. HQ 태그

HQ 태그는 히스티딘과 글루타민이 교대로 나타나는 서열(HQHQHQ)을 갖는 펩타이드 태그이다.

6. 2. HN 태그

HN 태그는 히스티딘과 아스파라진이 교대로 반복되는 서열(HNHNHNHNHNHN)을 가진 펩타이드 태그이다. His 태그보다 단백질 표면에 더 잘 노출될 가능성이 높으며[34], 고정화된 금속 이온에 더 효율적으로 결합하는 것으로 알려져 있다.[22][34]

6. 3. HAT 태그

닭의 젖산 탈수소 효소에서 유래한 펩타이드 태그(KDHLIHNVHKEEHAHAHNK)이다.[35] His 태그에 비해 전하 분포에 편향이 적고, 가용성 단백질이 될 가능성이 높다. 또한 His 태그보다 히스티딘 잔기들의 배치가 입체적이어서 고정화된 금속 이온에 더 효율적으로 결합하는 특징을 가진다.

참조

[1] 논문 Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent
[2] 문서
[3] 논문 Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation 1975-12
[4] 논문 Immobilized metal ion affinity chromatography 1992-08
[5] 웹사이트 His-tag: The timeless standard for protein purification https://cube-biotech[...] 2021-12-02
[6] 논문 Membrane protein expression and production: effects of polyhistidine tag length and position 2004-02
[7] 논문 Quantitative evaluation of neurotensin receptor purification by immobilized metal affinity chromatography 1997-10
[8] 논문 Double-hexahistidine tag with high-affinity binding for protein immobilization, purification, and detection on ni-nitrilotriacetic acid surfaces 2006-05
[9] 논문 Tagging the expressed protein with 6 histidines: rapid cloning of an amplicon with three options 2013-05-15
[10] 논문 Synthetic DNA Synthesis and Assembly: Putting the Synthetic in Synthetic Biology 2017-01
[11] 논문 Internal (His)₆-tagging delivers a fully functional hetero-oligomeric class II chaperonin in high yield 2016-02
[12] 논문 Double trouble-Buffer selection and His-tag presence may be responsible for nonreproducibility of biomedical experiments 2014-10
[13] 논문 Immobilized metal affinity chromatography optimization for poly-histidine tagged proteins 2020-10
[14] 서적 Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins Part A: Gene Expression and Protein Purification Academic Press 2000-01-01
[15] 논문 Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli 1995-07
[16] 논문 Production of low-expressing recombinant cationic biopolymers with high purity 2017-06
[17] 논문 Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification 2013-11
[18] 간행물 Protein–Protein Interactions: Pull-Down Assays https://hal.science/[...] Springer 2023-06-08
[19] 논문 Hexahistidine-tag-specific optical probes for analyses of proteins and their interactions 2010-04
[20] 논문 Genetic incorporation of 4-fluorohistidine into peptides enables selective affinity purification 2017-05
[21] 논문 Simplified detection of polyhistidine-tagged proteins in gels and membranes using a UV-excitable dye and a multiple chelator head pair 2020-08
[22] 특허 Polynucleotides encoding metal ion affinity peptides and related products https://patents.goog[...]
[23] 논문 Natural poly-histidine affinity tag for purification of recombinant proteins on cobalt(II)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose 1999-12
[24] 논문 Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation
[25] 논문 Immobilized metal ion affinity chromatography
[26] 논문 Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli
[27] 논문 An Escherichia coli protein consisting of a domain homologous to FK506-binding proteins (FKBP) and a new metal binding motif http://www.jbc.org/c[...]
[28] 문서 Talon Resin http://www.bioscienc[...]
[29] 논문 Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes
[30] 논문 Removal of N-Terminal Polyhistidine Tags from Recombinant Proteins Using Engineered Aminopeptidases
[31] 특허
[32] 특허
[33] 특허
[34] 특허
[35] 논문 Natural poly-histidine affinity tag for purification of recombinant proteins on cobalt(II)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose


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