웨스턴 블롯

3. 2D 겔 전기영동

2차원 SDS-PAGE는 위에서 설명한 원리와 기술을 사용한다. 2D SDS-PAGE는 이름에서 알 수 있듯이 2차원에서 폴리펩타이드의 이동을 포함한다. 예를 들어, 1차원에서 폴리펩타이드는 등전점에 따라 분리되고, 2차원에서 폴리펩타이드는 분자량에 따라 분리된다. 주어진 단백질의 등전점은 양전하(예: 라이신, 아르기닌) 및 음전하(예: 글루탐산, 아스파르트산)를 띤 아미노산의 상대적 수에 의해 결정되며, 음전하를 띤 아미노산은 낮은 등전점에 기여하고 양전하를 띤 아미노산은 높은 등전점에 기여한다. 또한, 샘플은 SDS-PAGE를 사용하여 비환원 조건에서 먼저 분리한 다음, 2차원에서 환원 조건에서 분리하여 서브유닛을 함께 유지하는 이황화 결합을 분해한다. SDS-PAGE는 2차원 겔을 위해 요소-PAGE와 결합될 수도 있다.

원칙적으로 이 방법을 사용하면 하나의 큰 겔에서 모든 세포 단백질을 분리할 수 있다. 이 방법의 주요 장점은 특정 단백질의 다양한 이소형을 구별하는 경우가 많다는 것이다. 예를 들어, 인산화된 단백질(음전하 그룹 첨가)이 있다. 분리된 단백질은 겔에서 잘라내어 질량 분석법으로 분석할 수 있으며, 질량 분석법은 단백질의 분자량을 식별한다.

4. 응용

웨스턴 블롯은 생화학에서 단일 단백질의 정성적 검출, 단백질 변형 확인을 위해 널리 사용되는 기법이다. 단백질 관련 논문의 최소 8~9%가 웨스턴 블롯을 적용하는 것으로 추정된다. 복잡한 단백질 혼합물에서 특정 단백질의 존재 여부를 확인하고, 블롯 막에 나타난 밴드의 크기와 색상 강도를 통해 단백질의 양을 반정량적으로 추정할 수 있다. 또한, 농도를 알고 있는 정제된 단백질을 사용하면 단백질 농도를 보다 정확하게 추정할 수 있다.



웨스턴 블롯은 HIV 검사, 소해면상뇌병증(광우병) 검사, 야토병 검사, 라임병 검사, B형 간염 및 HSV-2 감염 확진 검사, FIV 검사 등 다양한 질병 진단과 세계반도핑기구(WADA)의 혈액 도핑 검사 등에 활용된다.

4. 1. 질병 진단

• HIV 확진 검사: 인간 혈청 샘플에서 항 HIV 항체를 검출한다. 알려진 HIV 감염 세포의 단백질을 분리하여 막에 블롯팅한 후, 검사할 혈청을 적용하여 항체 반응을 확인한다.
• 변종 크로이츠펠트-야코프병(vCJD) 최종 검사: 소해면상뇌병증(광우병)에 걸린 소의 뇌조직에서 변형 프리온 단백질을 검출한다.^[28]
• 야토병 진단: ''F. tularensis''에 대한 항체 검출에 사용되며, 높은 민감도(거의 100%)와 특이성(99.6%)을 보인다.^[29]
• 라임병 검사: 일부 라임병 검사에 활용된다.^[30]
• B형 간염 및 HSV-2 감염 확진 검사: B형 간염 바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스 2형(HSV-2) 감염 여부를 확인하는 데 사용된다.^[9][10]
• FIV 검사: 수의학에서 고양이의 FIV 감염 상태를 확인하는 데 사용된다.^[11]
• 세계반도핑기구(WADA) 혈액 도핑 검사: 적혈구 생성을 촉진하는 약물 사용 여부를 확인하는 데 활용된다.^[31][32]

4. 2. 단백질 연구

4. 3. 도핑 검사

4. 4. 단백질 위치 확인

4. 5. 에피토프 매핑

5. 문제점 및 개선 방안

웨스턴 블롯(Western blot)은 실험 과정에서 다양한 문제가 발생할 수 있다. 대표적인 문제로는 낮은 신호 강도, 높은 배경, 비특이적 밴드 등이 있으며, 이는 단백질 분석 단계, 항체의 품질, 실험 조건 등 다양한 요인에 의해 발생한다.^[3]

이러한 문제를 해결하고 신뢰성 있는 결과를 얻기 위해 세포 용해물 준비 및 블롯팅 절차를 개선하고, 파-웨스턴 블롯, 확산 블롯팅, 단일 세포 분해능 웨스턴 블롯팅, 자동화된 미세 유체 웨스턴 블롯팅과 같은 새로운 기술들이 개발되어 활용되고 있다.^[3]

웨스턴 블롯 결과의 재현성을 확보하려면 시료 준비, 로딩에 사용된 단백질 농도, 젤의 퍼센트 및 전기영동 조건, 다양한 전이 방법, 블로킹 조건, 항체 농도, 식별 및 정량 결정 방법 등 다양한 변수를 보고해야 한다. 그러나 많은 논문에서 이러한 변수를 모두 다루지 않으므로, 웨스턴 블롯의 재현성과 정확성을 높이기 위한 최소 보고 기준이 필요하다.^[2][27]

5. 1. 낮은 신호 문제

5. 2. 다중 밴드 문제

5. 3. 높은 배경 문제

5. 4. 불규칙하고 고르지 않은 밴드

5. 5. 개선 방안

6. 결과 표현

연구자들은 웨스턴 블롯 결과의 시각적인 표현을 위해 이미지 섹션을 처리하고 정렬하는 다양한 소프트웨어를 사용한다. 널리 사용되는 도구에는 [http://sciugo.com Sciugo], 마이크로소프트 파워포인트, 어도비 일러스트레이터, GIMP 등이 있다.

참조

_[1] 논문 Western blot: technique, theory, and trouble shooting 2012-09
_[2] 논문 Western blotting: a powerful staple in scientific and biomedical research 2022-06
_[3] 논문 Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques 2017-11
_[4] 논문 Human Immunodeficiency Virus Diagnostic Testing: 30 Years of Evolution 2016-04
_[5] 논문 Western blot profile in HIV infection 2006
_[6] 논문 Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies 2002-06
_[7] 논문 A novel screening ELISA and a confirmatory Western blot useful for diagnosis and epidemiological studies of tularemia 2005-08
_[8] 논문 Western Blot as a confirmatory test for Lyme disease 1993-03
_[9] 논문 Western blot analysis of the reactivity between envelope proteins of hepatitis B viruses from Brazilian carriers and antibodies raised against recombinant hepatitis B vaccines https://pubmed.ncbi.[...] 2020-12-06
_[10] 논문 Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) Western blot confirmatory testing among men testing positive for HSV-2 using the focus enzyme-linked immunosorbent assay in a sexually transmitted disease clinic 2005-12
_[11] 웹사이트 FIV testing – which to use http://fivcats.com/F[...] 2020-12-06
_[12] 논문 Antidoping programme and biological monitoring before and during the 2014 FIFA World Cup Brazil 2015-05
_[13] 웹사이트 Application Note: Improved detection of EPO in blood and urine based on novel Velum SAR precast horizontal gels optimized for routine analysis https://precisionbio[...] 2015
_[14] 논문 Subcellular fractionation methods and strategies for proteomics 2010-11
_[15] 서적 Proteomics Data Analysis Springer US 2021
_[16] 논문 Epitope mapping of antibodies using a cell array-based polypeptide library 2010-04
_[17] 논문 Production, Characterization, and Epitope Mapping of Monoclonal Antibodies Against Different Subtypes of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus (RHDV) 2016-02
_[18] 논문 Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes 2013-12
_[19] 논문 An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research 2017-01
_[20] 논문 Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots https://hal.archives[...] 2017-10
_[21] 논문 Coomassie staining as loading control in Western blot analysis 2011-03
_[22] 논문 '[The double external auditory canal (author''s transl)]' 1973-10
_[23] 논문 Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots 2013-09
_[24] 논문 Epicocconone staining: a powerful loading control for Western blots 2014-02
_[25] 서적 Protein Blotting and Detection Humana Press
_[26] 서적 Western Blotting Springer New York 2015
_[27] 논문 Western Blotting Inaccuracies with Unverified Antibodies: Need for a Western Blotting Minimal Reporting Standard (WBMRS) 2015-08-19
_[28] 논문 Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies 2002-06-01
_[29] 논문 A novel screening ELISA and a confirmatory Western blot useful for diagnosis and epidemiological studies of tularemia 2005-02-16
_[30] 논문 Western Blot as a confirmatory test for Lyme disease 1993
_[31] 논문 Antidoping programme and biological monitoring before and during the 2014 FIFA World Cup Brazil 2015
_[32] URL https://precisionbio[...]
_[33] 논문 Tubulin or not tubulin: Heading toward total protein staining as loading control in western blots https://hal.archives[...] 2017-09-20
_[34] 논문 Coomassie Staining as Loading Control in Western Blot Analysis 2011-03-04
_[35] 논문 Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting 2012-09
_[36] 저널 Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting 2012-09
_[37] 저널 The double external auditory canal (author's transl)
_[38] 저널 Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots
_[39] 저널 Epicocconone staining: A powerful loading control for Western blots
_[40] 서적 Protein Blotting and Detection Humana Press