Taq 중합효소

3. 특성

Taq 중합효소는 DNA 복제 과정에서 몇 가지 중요한 특성을 가진다. 주요 단점 중 하나는 3' 말단에서 5' 말단 방향으로 작용하는 핵산 외부 가수분해 효소 (엑소뉴클레아제)의 DNA 수선 기능이 없다는 점이다.^[4] 이 때문에 복제 과정에서 오류가 발생해도 스스로 교정하지 못하여 상대적으로 낮은 복제 충실도(fidelity)를 보인다. 초기 연구에 따르면 오류 발생률은 약 9,000개의 뉴클레오타이드당 하나 정도로 측정되었다.^[32][8] 이러한 낮은 충실도 때문에, 유전자 클로닝이나 DNA 시퀀싱과 같이 높은 정확성이 요구되는 실험에서는 Pfu DNA 중합효소와 같이 교정 기능이 있는 다른 내열성 DNA 중합효소를 사용하기도 한다.^[17]

또 다른 특징은 DNA 합성 후 생성물의 3' 말단에 아데닌(A) 염기 하나가 돌출된 형태(overhang)를 만든다는 것이다. 이 특징은 TA 클로닝 기법에 유용하게 활용된다. TA 클로닝은 3' 말단에 상보적인 티민(T) 돌출부를 가진 플라스미드와 같은 클로닝 벡터를 사용하여, Taq 중합효소로 증폭된 DNA 조각을 별도의 제한 효소 처리 없이 벡터에 효율적으로 결찰(ligation)시키는 방법이다.

Taq 중합효소의 구조 내에서, 기능적으로 남아있는 두 개의 도메인(5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인과 중합효소 도메인)은 서로 연계된 움직임(coupled domain motion)을 통해 함께 작용한다.^[33][15]

3. 1. 효소 활성

또한 72°C에서는 10초 이내에 1000 염기쌍의 DNA 가닥을 복제할 수 있다.^[4][31] 최적 조건에서는 1초에 30-100염기의 복제를 수행한다.

Taq 중합효소는 높은 온도에서도 안정성을 유지한다. 반감기는 92.5°C에서 2시간 이상, 95°C에서 40분, 97.5°C에서 9분이다.^[4][29] 90°C 이상의 온도에서는 효소 활성이 거의 또는 전혀 나타나지 않지만, 효소 자체가 변성되지 않고 구조를 유지한다.^[5]

효소 활성은 반응 용기 내 특정 이온의 존재에 영향을 받는다. DNA 복제 반응에는 마그네슘 이온(Mg²⁺)이 필수적이며, 일반적으로 2 mM 정도의 염화 마그네슘이 포함된 완충액에서 반응을 수행한다. 최적의 Mg²⁺ 농도는 뉴클레오사이드 삼인산(dNTP)의 농도에 따라 결정되며, 과량의 Mg²⁺는 활성을 억제한다.^[6] 염화 칼륨(KCl)은 효소 활성을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 50 mM KCl에서 최대 활성을 보인다. 그러나 75 mM 이상의 고농도 KCl은 효소 활성을 억제한다.^[6] 염화 나트륨(NaCl)이나 0.02 % 크실렌 시아놀은 활성을 저해하지 않는다. 일반적인 금속 이온 킬레이터인 EDTA는 Mg²⁺와 같은 금속 이온이 없을 때 Taq 중합효소에 직접 결합할 수 있다.^[7]

수소 이온 농도(pH)는 7.5에서 9.5 사이에서 높은 효소 활성을 나타낸다.

3. 2. 도메인 구조

3. 2. 1. 엑소뉴클레아제 도메인

3. 2. 2. DNA와의 결합

3. 2. 3. 돌연변이

4. 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서의 역할

더무스 아쿠아티쿠스(''T. aquaticus'')는 온천이나 열수분출공과 같은 고온 환경에 서식하는 세균이다. Taq 중합효소는 이 세균에서 유래한 효소로, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 과정에서 요구되는 단백질 변성 조건, 즉 고온을 견딜 수 있는 특징을 가지고 있다.^[29] 이러한 특성 때문에 기존 PCR에 사용되던 대장균 유래 DNA 중합효소를 대체하게 되었다.^[30] Taq 중합효소는 75°C에서 80°C 사이에서 최적의 활성을 보이며, 92.5°C에서는 반감기가 2시간 이상, 95°C에서는 40분, 97.5°C에서는 9분이다. 또한 72°C에서 10초 이내에 1,000 염기쌍의 DNA 가닥을 복제할 수 있는 빠른 속도를 가진다.^[31]

1980년대 초, 캐리 멀리스는 세터스사(Cetus Corporation)에서 합성 DNA를 생명공학 분야에 적용하는 연구를 수행하고 있었다. 그는 DNA 염기서열 분석이나 cDNA 합성에 프라이머를 사용하고, 특정 DNA 가닥에 결합하는 탐침(probe)으로 올리고뉴클레오타이드를 활용하는 데 익숙했다. 1983년, 멀리스는 목표 DNA의 각 가닥에 핵산 혼성화될 수 있는 두 개의 프라이머를 사용하고, 반응 혼합물에 DNA 중합효소를 첨가하는 방법을 고안했다. 이 방법은 프라이머 사이의 특정 DNA 영역을 기하급수적으로 증폭시키는 결과를 가져왔다.^{[34][30][10][3]}

그러나 초기 PCR 방식에는 한계가 있었다. 각 DNA 복제 사이클마다 새로 합성된 DNA 이중 가닥을 분리(변성)시키기 위해 혼합물을 90°C 이상으로 가열해야 했다. 이 고온 단계는 다음 증폭 반응을 위한 주형 가닥을 만드는 데 필수적이었지만, 동시에 당시 사용되던 대장균 유래 DNA 중합효소 I의 클레노 단편을 비활성화시키는 문제가 있었다.

이러한 문제를 해결한 것이 바로 내열성 Taq 중합효소였다. Taq 중합효소는 DNA 가닥 분리에 필요한 95°C의 고온에서도 변성되지 않고 안정적으로 활성을 유지하므로 PCR에 매우 적합했다. 내열성 Taq 중합효소를 사용함으로써 다음과 같은 중요한 발전이 가능해졌다.

• PCR 반응을 60°C 이상의 고온에서 수행할 수 있게 되어 프라이머가 목표 DNA에 더 특이적으로 결합하게 되었다. 이는 프라이머 이량체와 같은 비특이적 생성물의 형성을 크게 줄여 반응의 정확도를 높였다.
• 열 순환 과정의 각 단계마다 새로운 효소를 첨가해야 하는 번거로움이 사라졌다. 이로 인해 전체 PCR 과정을 비교적 간단한 열 순환기 내의 단일 밀폐 튜브 안에서 자동으로 수행하는 것이 가능해졌다.

5. 특허 문제

호프만-라 로슈는 결국 세투스(Cetus)로부터 PCR 및 ''Taq'' 특허를 3.3억달러에 매입했으며, 이를 통해 세투스는 최대 20억달러의 로열티를 받을 수 있었다.^[11] 1989년, 사이언스는 ''Taq'' 중합효소를 최초의 "올해의 분자"로 선정했다.^[11] 캐리 멀리스(Kary Mullis)는 1993년 노벨 화학상을 수상했는데, 이는 생명공학 회사에서 수행된 연구로 수여된 유일한 상이었다.^[11] 1990년대 초반까지 ''Taq'' 중합효소를 사용한 PCR 기술은 기초 분자생물학 연구, 유전자 검사, 법의학 등 다양한 분야에서 널리 사용되었으며, AIDS 환자의 HIV 감염 여부를 직접 검출하는 데에도 중요한 역할을 했다.^[12]

그러나 1999년 12월, 미국 지방 법원 판사 본 워커(Vaughn Walker)는 ''Taq'' 중합효소와 관련된 1990년 특허가 세투스 코퍼레이션 소속 과학자들이 제출한 정보 중 일부 오해의 소지가 있거나 허위인 내용에 근거하여 발급되었다고 판결했다.^[13] 이 판결은 1991년에 ''Taq'' 특허를 매입했던 호프만-라 로슈를 상대로 프로메가(Promega Corporation)가 제기한 특허 무효 주장을 인정한 것이었다.^[13] 워커 판사는 판결의 근거로 신시내티 대학교 생물학과의 [https://www.newspapers.com/newspage/102153621/ 존 트렐라](John Trela) 교수 연구실을 포함한 다른 연구실에서 이루어진 선행 연구 결과들을 인용했다.^[13]

6. 질병 진단에서의 중요성

Taq 중합효소는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 과정에서 DNA 복제의 특이성을 높이고, 비특이적 산물의 생성을 줄이며, 과정과 장비를 단순화하는 개선을 가져와 질병 감지에 크게 기여했다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 감염성 질환 진단에 활용함으로써, 진단이 어려운 병원체에 의한 질병을 조기에 발견하고 적절한 치료를 가능하게 했다. 또한, 느리게 증식하는 미생물의 항균제 감수성을 파악하고 감염 정도를 확인하는 데에도 도움을 준다.^[23]

Taq 중합효소의 활용은 결핵, 연쇄상구균 인두염, 비정형 폐렴, 후천성면역결핍증후군(AIDS), 홍역, 간염, 궤양성 비뇨생식기 감염 등 여러 심각한 질병을 진단하는 데 핵심적인 역할을 수행하며 많은 생명을 구하는 데 기여했다. PCR은 특정 DNA 샘플의 복사본을 만드는 방법으로, 환자의 검체에서 목표 병원체의 특정 DNA 서열을 찾아낸 뒤 이를 수십억 배로 증폭시킨다. 이를 통해 극미량의 병원체 DNA만 존재하더라도 질병을 감지할 수 있다. 특히 인간면역결핍 바이러스(HIV) 감염 진단에서 PCR은 가장 정확한 방법 중 하나로 평가받지만, 상대적으로 높은 비용과 많은 시간 및 노동력이 요구되어 다른 검사법만큼 널리 사용되지는 않는다.^[24]

PCR 과정에서 촉매 역할을 하는 Taq 중합효소의 중요성은 2020년 COVID-19 팬데믹 당시에 크게 부각되었다. Taq 중합효소 공급이 부족해지면서 전 세계적으로 바이러스 검사 키트 생산에 차질이 빚어지기도 했다. 이 효소가 없다면 질병 진단 과정은 훨씬 더 느리고 복잡해진다.^[25]

PCR을 이용한 질병 진단에서 Taq 중합효소는 여러 장점을 가지지만 단점도 존재한다. 예를 들어 HIV, HTLV-1, HTLV-II과 같은 레트로바이러스 감염 질환은 유전체에 구아닌(G)이 아데닌(A)으로 바뀌는 돌연변이가 자주 나타난다. PCR 검사는 이러한 돌연변이를 표적으로 삼아 질병을 진단할 수 있지만, Taq 중합효소 자체의 정확도가 상대적으로 낮아 복제 과정에서 유사한 G-to-A 돌연변이를 일으킬 수 있다. 이는 결국 실제 감염되지 않았음에도 양성으로 판정되는 위양성(false positive) 결과를 초래할 위험이 있다.^[26]

참조

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